Mesure de l&#39;allodynie tactile dans un modèle murin de la prostatite bactérienne

Marsha L Quick; Joseph D Done; Praveen Thumbikat

doi:10.3791/50158

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Article de méthode

Mesure de l'allodynie tactile dans un modèle murin de la prostatite bactérienne

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DOI :

10.3791/50158

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16 janvier 2013

Marsha L Quick¹ , Joseph D Done¹ , Praveen Thumbikat¹

¹Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Infection de la prostate peut être un facteur contribuant à la médiation douleur pelvienne chez la prostatite chronique. Nous décrivons la procédure de préparation de l'inoculum bactérien standardisé, l'instillation de bactéries dans l'urètre chez les souris mâles et une méthodologie pour mesurer l'allodynie tactile chez la souris au fil du temps.

Résumé

Uropathogènes Escherichia coli (UPEC) sont des pathogènes qui jouent un rôle important dans les infections des voies urinaires et de la prostatite bactérienne ^1. Nous avons récemment montré que UPEC ont un rôle important dans le déclenchement de la douleur pelvienne chronique ^2, une caractéristique de la prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) ^3,4. Infection de la prostate cliniquement pertinente par UPEC peut initier et mettre en place la douleur chronique par des mécanismes pouvant entraîner des lésions tissulaires et l'initiation des mécanismes d'auto-immunité ^5.

Un défi à la compréhension de la pathogenèse de l'UPEC dans la prostate est l'inaccessibilité relative de la glande de la prostate à la manipulation. Nous avons utilisé une méthode précédemment décrite infection intra-urétrale ⁶ pour fournir une souche clinique de UPEC dans des souris mâles établissant ainsi une infection ascendante de la prostate. Ici, nous décrivons nos protocoles pour normaliser la bacterial inoculum ^7, ainsi que la procédure de cathétérisme sous anesthésie les souris mâles à une instillation de bactéries.

CP / CPPS est essentiellement caractérisé par la présence d'allodynie tactile ^4. Test comportement était basé sur le concept de l'hyperalgésie cutanée résultant de visées ^8-10 douleurs viscérales. Un accent irritable dans les tissus viscéraux réduit les seuils de douleur cutanée permettant une réponse exagérée à normalement non douloureuses stimuli (allodynie). Application de la force normale à la peau en raison des réactions anormales qui ont tendance à augmenter avec l'intensité de la douleur viscérale sous-jacente. Nous décrivons la méthodologie de NOD / ShiLtJ souris qui utilisent von Frey fibres de quantifier l'allodynie tactile au fil du temps en réponse à une seule infection par des bactéries UPEC.

Protocole

1. Préparation des bactéries pour inoculation à la souris

Ce qui suit doit être fait dans des conditions aseptiques.

Prendre un 17 x 100 mm tubes en polypropylène avec bouchons et ajouter 3 ml de bouillon Luria frais (LB) médias. En utilisant des pointes autoclave, prenez le stock de glycerol congelé bactéries de la souche CP1 ² et transférer une petite quantité de la culture dans le tube contenant le milieu LB. Remplacer le bouchon du tube de sorte que l'oxygène est encore capable de pénétrer dans le tube - la culture a besoin de grandir dans des conditions aérobies. Placer le tube à 37 ° C dans un incubateur agité à 220 tours par minute pendant la nuit.
Le lendemain, transférer 5 pl de culture d'une nuit dans un nouveau tube avec 3 ml du milieu LB et de grandir dans des conditions statiques dans un incubateur pendant la nuit à 37 ° C.
Au jour 3 de transfert de 40 ul de la culture dans le tube de 50 ml aa contenant 40 ml du milieu LB chacun. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit statique.
Activer et configurer centrifugeuse à 4 ° C.Une fois centrifugeuse a atteint la température finale, transférer 40 ml de chaque culture dans un tube de centrifugeuse de 40 ml Nalgene.
Peser les tubes d'équilibrer centrifugeuse - régler le volume avec du milieu LB, au besoin. Faites tourner les tubes à 6000 rpm pendant 20 min.
Retirez délicatement le surnageant et suspendre doucement culot bactérien dans 40 ml de PBS stérile.
Répétez l'étape 1.5 avec du PBS.
Aspirer le surnageant et suspendre les bactéries dans 500 ul de PBS stérile. Transférer la solution dans un tube de 1,5 ml. Prenez 10 pl de suspension et diluer dans 990 ul de PBS glacé. Utiliser un spectrophotomètre pour lire les DO _{420 nm} pour déterminer le volume nécessaire pour l'inoculation. Pour déterminer le volume approprié de PBS glacé de suspendre le culot dans: Prenez le nombre OD _{nm 420} (en ml) et on soustrait le volume estimé du culot bactérien [ex. OD _{420 nm} = 0,545, granulés d'environ 0,075 ml. 0,545 à 0,075 = 0,470].
Retirer 10 ul de suspension bactérienne et diluth dans 990 ul PBS glacé. Lire les _nm OD _420. L'objectif est d'atteindre une valeur de DO _{nm 420} pour la suspension diluée de 1,000 ± 0,010. Si le numéro de votre dilution est supérieure à cette cible, ajouter plus de volume à la suspension et prendre une autre lecture. Si le nombre est inférieur au 0,990 ensuite tourner vers le bas la suspension et répéter la lecture OD _{420 nm} jusqu'à l'obtention de lecture souhaitée.

2. L'infection des animaux

Souris (5 à 7 semaines, dix par groupe) ont été achetées auprès de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Les souris sont anesthésiées par inhalation de 1-4% d'isoflurane dans une chambre en plexiglas et sont surveillés jusqu'à couché.
Une souris à la fois est pris pour l'instillation de bactéries par cathétérisme avec un polyéthylène (PE10) de cathéter fixé à une aiguille G 30 modification d'une seringue Hamilton de verre (longueur de 1,5 à 2,0 cm). Le cathéter est inséré dans le moyeu de l'aiguille. La souris est placed sur sa surface dorsale sous anesthésie maintenue à l'aide d'un cône de nez.
Le pénis de la souris est extrudée par une pression douce et des quantités généreuses de lubrifiant sur les tampons de coton est utilisé pour la lubrification de l'entrée de l'urètre du pénis.
10 ul de tampon phosphate salin contenant 1 x 10 ⁸ bactéries est introduit dans l'urètre de souris anesthésiées après cathétérisme.
Les souris sont maintenues dans un état anesthésié pendant 15 min dans la chambre après l'introduction de plexiglas bactérienne pour permettre la fixation des bactéries et d'empêcher la miction immédiate.
Les souris sont replacés dans leurs cages et surveillé pour les prochaines 24 heures.

3. Test comportement

Les souris ont été testés avant l'infection (de base) et aux jours 3, 7, 14, 21 et 28 après l'infection. Appelé l'hyperalgésie et l'allodynie tactile a été testée à l'aide filaments von Frey appliquées à l'abdomen et le r ^11,12 plantaireégion de la patte arrière ^13. Les tests ont été perfomed à un temps fixe de la journée, la méthodologie standard et tests expérimentateur seul de tous les animaux ont été utilisés. Tests en aveugle des groupes a été utilisé pour lutter contre les limitations de comportement basée sur les tests douleur dans des modèles animaux. Cinq différents filaments von Frey avec les forces de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 et 4,0 g (Stoelting, Etats-Unis) ont été appliquées à l'abdomen et la fréquence des réactions de sevrage a été calculé.

Après une période de 30 minutes d'acclimatation, les souris sont placées dans des chambres individuelles en plexiglas (6 x 10 x 12 cm) réalisés en interne avec un plancher grillagé en fil d'acier inoxydable.
Appelé l'hyperalgésie et l'allodynie tactile ont été testés en utilisant les cinq filaments von Frey. Chaque filament a été appliqué pendant 1-2 secondes avec un intervalle inter-stimulus de 5 sec pour un total de 10 heures, et les poils ont été testés dans l'ordre croissant de la force.
Chaque filament est appliqué à la région abdominale inférieure dans le voisinage général de la prostate eton a pris soin de stimuler les différentes zones de cette région pour éviter la désensibilisation ou "liquider" les effets. Filaments ont été appliqués dans l'ordre croissant de la force pour 1-2 secondes avec des intervalles d'au moins 5 sec entre stimulations pour un total de 10 fois.
Trois types de comportement sont considérés comme une réponse positive à la stimulation du filament: 1) la rétraction brutale de l'abdomen; 2) lécher ou gratter immédiate de la zone de stimulation filament; 3) saut.
Réponse en fréquence a été calculée comme le pourcentage de réponses positives (sur 10, par exemple, 5 réponses 10 = 50%) et des données a été signalé que le pourcentage moyen de réponse en fréquence ± SE
Animaux de plus de 25 réponses positives de référence totales sont exclus de l'étude.
Allodynie tactile a été testé sur la région plantaire de la patte arrière à l'aide filaments von Frey avec les forces de 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 et 4,0 g. Le seuil de retrait médiane de 50% (5) a été évaluée en utilisant le haut-basméthode où le test a été lancé avec 0,04 g de filament appliqué perpendiculairement à la surface plantaire de la patte arrière jusqu'à ce que le filament légèrement fléchis. Filaments ont été testés dans l'ordre croissant jusqu'à ce qu'une réponse positive a été observée. Une réponse positive à filament a été définie comme étant soit un retrait brusque de la patte ou le léchage de la patte d'essai. Si une réponse positive a été enregistrée le filament côté plus faible a été appliquée, et si une réponse négative a été observée, puis le filament fort suivant a été appliqué.
Les expériences et les méthodes décrites ont été examinés et approuvés par les soins des animaux du Nord-Ouest et l'Université utiliser comité.