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Article de méthode

L'utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

30.9K vues

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DOI :

10.3791/50168

⸱

14 octobre 2013

 ,  , 
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Dans cet article

Résumé

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

Résumé

Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l'engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d'étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires - y compris l'expression des gènes et le métabolisme - et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l'évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d'un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l'évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l'utilisation des chémostats dans la recherche biologique.

Introduction

La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d'interaction des facteurs génétiques et environnementaux 1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l'étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées.

La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod 3 et Novick et Szilard 4 en 1950. Conçu à l'origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l'élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d'un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d'équations prédit un seul (non nul) stable à l'état d'équilibre (figure 3) avec l'implication remarquable à l'état d'équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c'est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d'établir des populations à l'état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments.

Le contrôle expérimental des taux de croissance à l'aide chémostats était essentielle pour le développement d'une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de 5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l'explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd'hui, un regain d'intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l'avènement de méthodes échelle du génome pour l'analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l'utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l'environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d'abord, nous décrivons l'utilisation de chémostats d'étudier comment l'abondance de milliers de biomolécules - tels que les transcriptions et des métabolites - sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l'évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l'environnement et l'évolution adaptative.

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Protocole

Le principe de la culture en continu en utilisant un chemostat peut être réalisée dans une variété de mises en œuvre. Dans tous les chémostats il est essentiel d'avoir une) méthodes pour maintenir la stérilité de tous les composants, 2) une culture bien mélangé, 3) l'aération appropriée du récipient de culture et 4) un moyen fiable de plus de médias et l'élimination de la culture. Ici, nous décrivons l'utilisation d'un bioréacteur Sixfors (Infors Inc) en chemostat en utilisant des procédés qui peuvent être facilement adaptés à d'autres configurations.

Une. Assemblage des navires Chemostat

  1. Allumez les Sixfors l'aide de l'interrupteur principal.
  2. Bien rincer le récipient chimiostatique, Ensemble agitateur, et le tube attaché avec (DI) de l'eau déminéralisée. Vérifiez tous les tuyaux et les joints toriques et remplacer les pièces usées à la recherche.
  3. Assurez-vous que la base de support d'arbre d'entraînement est tourné vers le haut dans le récipient en verre et que la partie supérieure de l'arbre d'entraînement est remis dans son logement sur l'ensemble de l'agitateur. Réglez le stirrer ensemble dans le récipient de verre assurant le bas de l'arbre d'entraînement est logé dans le support d'arbre d'entraînement. Utiliser la pince pour fixer l'ensemble de l'agitateur dans la cuve de verre.
  4. Remplissez le réservoir avec environ 300 ml d'eau déminéralisée.
  5. Retirez les bouchons d'un oxygène dissous (DO 2) sonde et vérifier le niveau d'électrolyte en dévissant le boîtier en bas et en veillant à ce que le boîtier de fond est à moitié rempli avec une solution d'électrolyte. Replacer le boîtier en bas et l'insérer dans le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
  6. Prenez une sonde de pH et la retirer de son tampon de stockage (3 M de KCl). Retirez le capuchon de la sonde de pH et le joindre à fermenteur 1. Utilisation de l'écran de contrôle Sixfors, accédez au menu des paramètres de fermentation et sélectionnez "calibrer pH". Placer la sonde de pH dans un tampon à pH 7 standard et fiche de lecture en tant que Haut Lire. Répéter l'opération avec tampon à pH 4 et enregistrer la lecture en bas Lire. Détacher la sonde de pH de fermentation, laver avec de l'eau DI et insérer la sonde into le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
  7. Placer le récipient chimiostatique dans le rack. Remarque sur le navire qui fermenteur (1-6) de la sonde de pH a été connecté et calibré. Placez la sonde de pH bouchon sur la sonde de pH. Utilisant une feuille couvre bien le haut de la sonde à oxygène 2.
  8. Plier la feuille sur les extrémités de la tubulure attachée au récipient chimiostatique.
  9. Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les navires.
  10. Stériliser les navires en leur autoclavage pendant 15 min sur un cycle liquide.

2. Préparation des supports

  1. Établir la gamme de limitation des concentrations de nutriments par la croissance des cultures en lots de différentes concentrations d'éléments nutritifs. Le nutriment est limitant dans la plage où la densité cellulaire finale est une fonction linéaire de la concentration des éléments nutritifs initiale (figure 4). Sélectionnez une concentration des éléments nutritifs dans la fourchette de limitation. Des exemples de composition de médias standard pour les études avec Saccharomyces cerevisiae sont disponibles en 11.7.
  2. Autoclave une bonbonne vide qui est coiffé d'un bouchon de caoutchouc contenant une entrée d'air et une sortie de média après la première assurant que l'extrémité du tube de support est recouvert d'une feuille.
  3. Dans un récipient séparé préparer 10 litres de médias.
  4. Fixer un filtre de 500 ml tasse à une bouteille de 100 ml de médias. Retirez le filtre de coton avec des pinces stérilisées dans de l'éthanol et joindre immédiatement au port de filtration sur la bonbonne de médias.
  5. Fixez la bonbonne de médias à une source de vide et filtre stériliser les médias en l'ajoutant à la coupe du filtre.
  6. Lorsque la filtration des médias est terminée, fermer le port de filtration avec une pince métallique.

3. Calibrage faire 2 sondes et Configuration Chemostat

  1. Après les vaisseaux chémostat ont été autoclave et laisser refroidir endroit du navire dans son enveloppe de chaleur correspondant. Connectez la sonde de température, sonde de pH et DO 2 sonde. Laissez lenavire s'asseoir avec le pouvoir pendant au moins 6 heures pour permettre aux DO 2 sondes à polariser.
  2. Placez l'extrémité de chaque tube effluents dans un récipient de collecte séparée. Connectez l'alimentation en air via un filtre autoclave et tourner sur la circulation d'air. L'eau dans chaque récipient doit s'écouler des tubes des effluents, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés.
  3. Ajuster la hauteur du tube d'effluent en fonction du volume de travail désirée (par exemple, 300 ml). Nous utilisons une règle qui est marqué avec des stages de tubes calibrés pour différents volumes de travail.
  4. Connectez la bonbonne de médias dans le récipient de chemostat. Utiliser de l'éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stérile que possible. Enfiler le tuyau de la pompe à travers la pompe et la pince ouverte. Appuyer manuellement sur la pompe jusqu'à ce que les médias commencent à s'écouler dans le récipient chimiostatique. Relâchez tube de la pompe, les médias doivent circuler librement dans le récipient chemostat. Lorsque le support atteint le tube effluent, rattacher tube à la pompe et serrer.
  5. Lancer running le programme de base avec roue ensemble à 400 tours par minute et la température réglée à 30 ° C.
  6. Pour calibrer faire 2 sondes, couper l'arrivée d'air et passer au gaz d'azote. Attendez au moins une heure et enregistrer la valeur de mesure comme «faible en lecture". Revenez à alimentation d'air (c'est à dire contenant la concentration en oxygène ambiante), attendez au moins une heure supplémentaire et la mesure d'enregistrement comme "une grande lecture».
  7. Lancer l'enregistrement de données en utilisant le logiciel Iris.

4. Inoculation

  1. Utiliser 70% d'éthanol pour stériliser la partie supérieure de la cuve de culture.
  2. Retirez la vis sur le dessus de la cuve et pipette 1 ml d'une culture de la nuit dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis.
  3. Indiquer le moment de l'inoculation dans Iris.
  4. Attendez environ 24 h pour les cultures d'atteindre la phase stationnaire précoce. Comme la culture se développe, l'oxygène dissous et le pH diminue. Dans le cas des milieux de glucose limitatif, l'oxygène dissous va revenir à ~ 100% en pha stationnairese. Pour les autres restrictions de nutriments oxygène dissous restera <100% en phase stationnaire.

5. Lancement de pompes et d'atteindre l'état d'équilibre

  1. Le taux de dilution est calculé en divisant le débit (la quantité de support s'écoule dans la cuve par heure) par le volume de la culture. Par exemple, en utilisant un volume de 300 ml, un taux de dilution de 0,1 signifie que 30 ml de milieu est ajouté à la culture par heure. Parce que le système est sous pression positive le même volume est retirée de la cuve en sorte que la culture est diluée de manière continue. Une gamme de taux de dilution (D) peut être utilisé qui ne dépasse pas la vitesse maximale de croissance (μ max) des cellules, les cellules ci-dessus, qui seront éliminés par lavage du chemostat.
  2. Choisissez réglages de la pompe, qui précisent le nombre de secondes, la pompe est sur et en dehors, pour établir le débit souhaité. La pompe délivre médias à un taux d'environ 0,11 ml / sec.
  3. Définir un programme utilisant l'int Sixforserface qui spécifie le calage de la pompe, la température et la vitesse de la turbine. Démarrez le programme.
  4. Videz les récipients collecteurs de liquide et enregistrer le temps.
  5. Après au moins deux heures, utiliser un cylindre gradué pour mesurer combien les médias a été retiré de la cuve. Ce sera égal au volume qui a été ajoutée au récipient de chemostat. Calculer le taux (D = V effluents / V culture / heure) dilution. Réglez les paramètres de la pompe si le taux de dilution calculé ne correspond pas à taux de dilution désiré.
  6. A l'état d'équilibre, la densité des cellules dans le chemostat ne change pas au fil du temps. Ceci peut être mesuré sans perturber la culture en échantillonnant la sortie. Nous définissons opérationnel atteindre l'état d'équilibre que les mesures de densité de cellules identiques qui sont séparés par au moins un doublement de la population. Atteindre l'état d'équilibre prendra environ huit générations de la culture après le début de la culture dilution. A l'état d'équilibre, les cellules se développent de façon exponentielle (i.e. taux de croissance constant au cours du temps) dans des conditions nutritives limitée. Le temps de doublement de la population (temps de génération) est ln (2) / D.
  7. Continuer à mesurer périodiquement le volume des effluents pour la durée de l'expérience pour s'assurer que le taux de dilution constant est maintenu.

6. Application 1: étude des cellules en croissance à des taux différents dans l'état d'équilibre

  1. A l'état d'équilibre dans le chemostat, le taux de la population de cellules de croissance est égal au taux de dilution. En modifiant systématiquement le taux de dilution, il est possible de cultiver des cellules à des vitesses différentes. Ceci permet l'étude systématique des paramètres physiologiques qui varient avec le taux de croissance y compris le volume des cellules, l'étape du cycle cellulaire et de la résistance au stress. En outre, les profils état d'équilibre de l'ARNm mondiale, les protéines et les niveaux de métabolites peuvent être testés dans des cellules en croissance à des taux différents. Il ya deux façons d'acquérir des échantillons:
  2. Petits échantillons peuvent être passivement obmaintenue en plaçant l'extrémité du tube d'effluent dans un tube de 1,5 ml ou de 15 ml. Un échantillon de 5.1 ml peuvent être obtenus en quelques minutes (en fonction de la vitesse d'écoulement). De nombreux paramètres physiologiques peuvent être mesurées à partir de ces échantillons.
  3. expression des gènes, ou de métabolites analyses nécessitent des échantillons plus larges qui doivent être obtenus le plus rapidement possible. Placer l'extrémité du tube d'effluent dans un tube conique de 15 ml. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement. A ~ 10 ml d'échantillon remplira rapidement votre tube. Garder à l'esprit que le volume dans le récipient chimiostatique a changé. Si plusieurs échantillons consécutifs sont prises, il peut être nécessaire de réduire le débit pour maintenir un taux de dilution constant.

7. Application 2: la mesure précise des différences de taux de croissance entre les génotypes dans des environnements contrôlés en utilisant des analyses de la concurrence fondée sur cytométrie de flux

  1. Chémostats peuvent être utilisés pour quantifier avec précision l'effet de la concentration en éléments nutritifssur les différences de taux de croissance (c'est à dire de remise en forme) entre différents fonds génétiques. Par des souches de co-culture marquées avec différentes protéines fluorescentes de la vitesse de variation de l'abondance relative pendant la croissance exponentielle est déterminée. Réalisation de ce test à différents taux de dilution (D) permet l'étude des effets de la concentration (s) nutriment sur ​​les différences de remise en forme.
  2. Établir les cultures des deux souches dans les vaisseaux chémostat séparées avec des taux de dilution identiques et un volume de 300 ml état d'équilibre.
  3. Passivement échantillon de 1 ml de chaque navire. Spin bas cellules, remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) et le lieu à 4 ° C. Ces échantillons contiennent des échantillons de cellules homogènes, qui sont des commandes pour l'analyse de cytométrie de flux subséquente.
  4. Placer le tube effluent d'un navire dans une éprouvette graduée autoclave. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement vers le bas pour expulser les cellules du chemostat. Quandle volume atteint 150 ml, retourner l'extrémité métallique du tube effluent à sa position initiale (300 ml). Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant une éprouvette graduée différente.
  5. Utilisation éthanol à 70% pour maintenir la stérilité tout en enlevant les vis sur la partie supérieure du récipient chimiostatique. Placez l'entonnoir dans l'ouverture et versez 150 ml de l'autre culture dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant le second entonnoir. Chaque récipient chimiostatique contient maintenant un mélange des deux souches.
  6. Obtenir un échantillon de 1 ml de chaque navire par échantillonnage passif chaque 2-6 h. Isoler les cellules, remettre en suspension dans du PBS et conserver à 4 ° C. Continuez à prendre des échantillons pour l'enregistrement 2-3 jours soigneusement le temps de chaque échantillon a été prélevé.
  7. A la fin de l'expérience, traitement par ultrasons et diluer les échantillons à ~ 2 x 10 6 cellules / ml. En utilisant la cytométrie en flux, de mesurer la proportion des deux souches dans chaque échantillon. Comme les deux souches sont en croissance exponentielle, la différence de taux de croissance relative estdéterminé par régression linéaire de ln (strain1/strain2) en fonction du temps (mesuré dans les générations). La pente de la régression est proportionnelle à la différence dans le taux de croissance (c'est à dire l'avantage de gym) d'une souche par rapport à l'autre.
  8. Comme la culture mixte peut prendre un certain temps pour atteindre un nouvel état d'équilibre, des points de temps au début peuvent s'adapter mal à la régression. Ce problème est résolu meilleur en permettant 2-3 générations s'écouler avant le début de l'échantillonnage ou de retirer début points qui sont aberrantes claires. Inversement, une fois une souche a surpassés l'autre, les données ne sont plus utiles et ces points doivent être exclus.

8. Application 3: Evolution expérimentale

  1. Évolution expérimentale effectuée dans chémostats sélectionne des mutants qui augmentent dans la forme physique dans l'environnement des éléments nutritifs limités. La sélection est généralement effectuée sur des centaines de générations.
  2. Établir une culture chimiostatique l'état d'équilibre en utilisant une souchegénotype connu (et la séquence du génome de préférence connu) et un nutriment limitation définie.
  3. Pour maintenir un «fossiles» de la population d'adaptation passive échantillon chemostat tous les 2-3 jours et stocker l'échantillon dans 15% de glycérol à -80 ° C.
  4. Surveiller le réservoir de médias et de reconstituer des milieux frais comme nécessaires.
  5. Maintenir la culture en croissance exponentielle pour plusieurs centaines de générations.
  6. Après l'achèvement de la plaque de sélection d'un échantillon de cellules sur des plaques de gélose solide. Après que les cellules ont grandi dans les colonies, choisir un échantillon biaisé de colonies à l'aide de cure-dents et inoculer clones dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant 100 pi de milieu. Permettre aux échantillons de clones de croître pendant la nuit, ajouter 100 ul de 30% de glycérol et en magasin -80 ° C.
  7. Caractériser clones par séquençage du génome entier et effectuer des dosages phénotypiques y compris l'évaluation de la condition physique, en utilisant une souche de référence marqué par fluorescence commun, tel que décrit dans la demande 2.

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Résultats

Un avantage majeur de chémostats est la capacité de contrôler le taux de croissance des cellules expérimentalement en faisant varier le taux de dilution. Chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, la morphologie d'une cellule est informative de la phase dans le cycle de la division cellulaire. Populations avec des taux de croissance plus élevés contiennent une proportion plus élevée de division active des cellules tel que déterminé par la mesure de la fraction de cellules unbudded (figure 5A).

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Discussion

Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l'environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l'interaction complexe de l'environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dans chémostats ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage forment la New York University. Nous remercions Maitreya Dunham et Matt Brauer qui a initialement développé l'utilisation de bioréacteurs Sixfors comme chémostats.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Infors-HT Sixfors ChemostatAppropriate Technical Resources, Inc.  ;
Bouteille en verre 9,5 LFisher Scientific02-887-1Pour récipient multimédia et
PinchcockFisher Scientific05-867Pour récipient multimédia et bouchon de tuyau
, taille 12, néoprène vertCole-PalmerEW-62991-42Pour récipient multimédia et
tuyau Connecteur droitCole-PalmerEW-30703-02Pour récipient multimédia et tuyau
Général 4 poFisher ScientificNC9557052Pour cuve de média et tube de tuyau
,Petites piècesB000FMWTDEPour cuve de média et tube de tuyau
, silicone, 3/8 po de diamètre extérieurFisher Scientific02-587-1QPour récipient de média et tube de tuyau
, silicone, 7/32 po de diamètre extérieurFisher Scientific02-587-1EPour récipient de média et tuyau
Tubes, acier inoxydable, 3/16 po ODMcMaster-Carr6100K164Pour cuve de média et tube de tuyau
, acier inoxydable, 3/8 po ODMcMaster-Carr6100K161Pour cuve de média et
connecteurs de crochetFisher Scientific14-66-18QPour cuve de média et
tuyau Pince à cliquetCole-PalmerEW-06403-11Pour cuve de média et tuyau
Luer, FemelleCole-PalmerEW-45512-34Pour Récipient de Média et Tuyau
Luer, MâleCole-PalmerEW-45513-04Pour Récipient de Média et
Tuyau Millipore Aervent MTGR05010 Filtre de 62 mm, 0.2 &mu ; mFisher ScientificMTGR05010Pour cuve de média et tuyau
Filtres PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0,2 &mu ; mFisher ScientificNC9131037Pour récipient de média et tuyau
Tube d’écoulement à lecture directe pour l’airCole-PalmerEW-32047-77Pour la configuration de l’azote
gazeux Tube d’écoulement à lecture directe pour l’azoteCole-PalmerEW-32048-63Pour la configuration de l’azote
Proportionneur de gaz Cadres multitubesCole-PalmerEW-03218-50Pour la configuration de
l’azote gazeuxRégulateur, airgas analytique à deux étagesY12-N145D580pour la configuration de l’azote Adaptateur
tuyau, acier inoxydableAirgasY99-26450Pour la configuration de l’azote
Adaptateur mâleAirgasWES544Pour la configuration de l’azote gazeux
Tube NorpreneUS Plastics57280Pour la configuration de l’azote Gaz
Base de trépiedCole-PalmerEW-03218-58Pour l’installation de l’azote
gazeux Cartouches de soupapeCole-PalmerEW-03217-92Pour l’installation de l’azote gazeux
Carboy 10 LFisher Scientific02-963-2APour la préparation des médias
Steritop Filtres stériles pour bouteilles sous vide, 1 000 ml, membrane PES ; pour un col de 45 mmFisher ScientificSCGP-T10-REPour la préparation des médias
Flacon de média 100 ml, taille ducol de 45 mmFisher ScientificFB-800-100Pour la préparation des milieux chlorure
de calcium · ; 2H2OFisher ScientificC79-500Réactifs
média chlorure de sodiumFisher ScientificBP358-1Réactifs de
média sulfate de magnésium· ; Médias 230391 7H2OSigma AldrichRéactifs Média
de potassium monobasiqueFisher ScientificAC424205000Réactifs
Sulfate d’ammoniumFisher ScientificAC423400010Réactifs Chlorure
potassiumSigma AldrichP9541Milieux Réactifs
Acide boriqueSigma AldrichB6768Réactifs de
milieu sulfate de cuivre & middot ; 5H2OSigma Aldrich209198Media Réactifs
iodure de potassiumSigma Aldrich60400Réactifs
chlorure ferrique· ; 6H2OFisher ScientificI88-100Réactifs de média
sulfate de manganèse · ; H2OSigma Aldrich230391Media Reagents
molybdate· ; 2H2OSigma AldrichM7634Réactifs de milieu
sulfate de zinc· ; 7H2OFisher ScientificZ68-500Réactifs de média
biotineFisher ScientificBP232-1Réactifs de
pantothénate de calciumFisher ScientificAC24330-1000Réactifs
d’acide foliqueSigma AldrichF7876Réactifs de média
inositol (alias myo-inositol)Fisher ScientificAC12226-1000Réactifs de média
niacine (alias acide nicotinique)Sigma AldrichN4126Réactifs de média
acide p-aminobenzoïqueFisher ScientificAC14621-2500Réactifs de média
pyridoxine HClSigma AldrichP9755Réactifs
de média riboflavineSigma AldrichR4500-25GRéactifs de
média thiamine HClFisher ScientificBP892-100Réactifs de média
LeucineSigma AldrichL8000-100GRéactifs de média
UracilSigma Aldrich U0750Réactifs
de média DextroseFisher ScientificDF0155-08-5Réactifs de média
tuyau en caoutchouc de silicone de tuyau gazeux de de Phosphate de sodium

Références

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