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L'activation des neurones somatosensoriels optogenetic poisson zèbre en utilisant Chef-tdTomato

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DOI :

10.3791/50184

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31 janvier 2013

 , 
1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Optogenetic techniques ont permis d'étudier la contribution des neurones spécifiques de comportement. Nous décrivons une méthode larvaire chez le poisson zèbre pour l'activation de simples neurones somatosensoriels exprimant une variante channelrhodopsin (Chef) avec un pompé par diode à l'état solide (DPSS) laser et d'enregistrer les comportements suscité avec une caméra vidéo à grande vitesse.

Résumé

Le poisson-zèbre larvaires sont en train de devenir un modèle pour décrire le développement et la fonction de simples circuits neuronaux. En raison de leur fécondation externe, développement rapide, et la translucidité, le poisson zèbre sont particulièrement bien adaptés pour les approches optogenetic pour étudier la fonction des circuits neuronaux. Dans cette approche, les canaux ioniques sensibles à la lumière sont exprimés dans les neurones spécifiques, permettant à l'expérimentateur d'activer ou d'inhiber les modifier à volonté et ainsi évaluer leur contribution à des comportements spécifiques. L'application de ces méthodes chez le poisson zèbre larvaire est conceptuellement simple mais nécessite l'optimisation des détails techniques. Ici, nous démontrons une procédure pour exprimer une variante channelrhodopsin dans les neurones somatosensoriels larves de poisson zèbre, photo-activation des cellules individuelles, et d'enregistrer les comportements qui en découlent. En introduisant quelques modifications aux méthodes établies précédemment, cette approche pourrait être utilisée pour obtenir des réponses comportementales de neurones isolés activés jusqu'àd'au moins 4 jours post-fécondation (DPF). Plus précisément, nous avons créé un transgène l'aide d'un neurone somatosensoriel amplificateur, CREST3, pour diriger l'expression de la variante marquée channelrhodopsin, chef-tdTomato. L'injection de ce transgène dans embryons en stade 1-cellule se traduit par l'expression dans les neurones de la mosaïque somesthésiques, qui peut être imagé par microscopie confocale. Illuminating identifié les cellules de ces animaux avec de la lumière provenant d'un laser DPSS nm 473, guidé par un câble à fibre optique, suscite des comportements qui peuvent être enregistrées avec une caméra vidéo à grande vitesse et analysés quantitativement. Cette technique pourrait être adapté à l'étude des comportements suscités par l'activation de n'importe quel neurone poisson zèbre. En combinant cette approche avec des perturbations génétiques ou pharmacologiques sera un moyen puissant pour étudier la formation des circuits et de la fonction.

Introduction

Le développement de méthodes optogenetic pour favoriser ou inhiber l'excitabilité neuronale des longueurs d'onde de la lumière défini a permis d'étudier la fonction des populations distinctes de neurones dans les circuits neuronaux contrôlant le comportement 1, 19, 21. Cette technique est souvent utilisée pour activer des groupes de neurones, mais il peut aussi être utilisé pour activer des neurones individuels. Embryons de poisson zèbre sont particulièrement favorables à ces méthodes car elles sont translucides, leur système nerveux se développe rapidement, et la création d'animaux transgéniques est rapide et la routine. Toutefois, d'importants obstacles techniques doivent être surmontés pour atteindre de manière fiable activation seul neurone.

Pour optimiser une procédure pour l'activation des neurones optogenetic poisson zèbre simples, nous nous sommes concentrés sur les neurones somatosensoriels. Embryons de poisson zèbre détecter une variété de stimuli somatosensoriels l'aide de deux populations de neurones: les neurones du trijumeau, qui innervent la tête, et Rohon-Barbe (RB), les neurones qui innervent le reste du corps. Chaque neurone du trijumeau et RB projette un axone périphérique qui se ramifie abondamment dans la peau pour détecter des stimuli et un axone central qui se connecte à circuits neuronaux en aval. Animaux réagissent au toucher dès 21 heures après la fécondation (HPF), indiquant que les circuits cohérents somatosensoriels ont formé 5, 18. Au cours du développement larvaire au moins une synapse du trijumeau et RB neurones sur la cellule de Mauthner pour activer réactions de fuite classiques, mais l'accumulation de preuves suggère qu'il existe plusieurs classes de neurones somatosensoriels avec différents modèles de connectivité qui peuvent susciter des variations sur le comportement Escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Notre motivation pour développer cette méthode était de caractériser la fonction du comportement des différentes classes de neurones somatosensoriels, mais cette approche pourrait en principe être utilisée pour étudier la fonction des neurones presque toute ou d'une population de neurones dans larval poisson zèbre.

Douglass et al. Précédemment décrit un procédé d'activation channelrhodopsin-2-exprimer neurones somatosensoriels avec la lumière bleue, provoquant 3 Comportement fuite. Leur approche utilisée un élément activateur du gène Isl1 pour diriger l'expression de ChR2-EYFP dans les neurones somatosensoriels. Ce transgène, cependant, a été signalé pour afficher une fluorescence relativement faible, ce qui nécessite la co-injection d'un deuxième rapporteur, SAMU :: GFP, pour permettre la visualisation des cellules exprimant ChR2-EYFP. Cette approche a été utilisée pour obtenir des réponses de comportement entre 24-48 hpf, mais n'a jamais pu obtenir une réponse cours des dernières 72 hpf. Ainsi, bien que cette méthode fonctionne pour l'étude de circuits neuronaux à très premiers stades larvaires (24-48 hpf), elle est insuffisante pour caractériser les circuits neuronaux et des réponses comportementales dans les larves plus âgées, quand plus diverses réactions comportementales sont apparentes et les circuits neuronaux sont plus matures.

Nous avons cherché àaméliorer la sensibilité de cette technique dans le but de caractériser la fonction de sous-populations de neurones RB larvaires. Pour améliorer l'expression on utilise un activateur spécifique somesthésiques (CREST3) 20 pour diriger l'expression de LexA-VP16 et un tronçon de séquences d'opérateurs LexA (4xLexAop) 11 pour amplifier l'expression d'un marquées par fluorescence canal activé par la lumière. Cette configuration amplifié expression du canal, ce qui élimine la nécessité d'une co-expression d'un journaliste de seconde et qui nous permet de déterminer directement l'abondance relative de la voie dans chaque neurone. En utilisant la séquence LexA / LexAop a l'avantage supplémentaire de permettre d'introduire le transgène dans des lignes de reporter poisson zèbre qui utilisent le système Gal4/UAS. L'expression transitoire de ce transgène donné lieu à différents niveaux d'expression, mais était généralement assez robuste pour visualiser à la fois le corps cellulaire et les projections axonales des neurones individuels sur plusieurs jours. Pour optimiser la sensibilitélité à la lumière, nous avons utilisé la lumière activée canal chef, une variante channelrhodopsin constitué d'une chimère de channelopsin-1 (Chop1) et channelopsin-2 (Chop2) avec un site de liaison à une hélice boucle EF 13. Ce canal est activé à la même longueur d'onde que ChR2, mais nécessite plus faible intensité lumineuse pour l'activation, la rendant plus sensible que les autres canaux couramment utilisés, y compris ChR2. La protéine chef était fusionnée à la protéine fluorescente rouge, tdTomato, ce qui nous permet de cribler l'expression de protéines sans activer le canal. Comme une source de lumière, nous avons utilisé un pompé par diode à semi-conducteurs (DPSS) laser couplé à un câble à fibre optique pour offrir une précision, une grande puissance d'impulsion de lumière bleue à une région spécifique des larves. Cela nous a permis de focaliser la lumière laser sur les neurones individuels, éliminant ainsi la nécessité de trouver de rares animaux transgéniques exprimant le canal en un seul neurone. En utilisant cette approche, nous avons réussi à activer les neurones RB simples, enregistrer la réponse comportementales avec une caméra vidéo à grande vitesse, et les neurones d'image à haute résolution activés par microscopie confocale.

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Protocole

Préparez les éléments suivants à l'avance.

1. Préparer câble optique

  1. Créer une unité de stockage pour le câble optique en faisant fondre le col effilé d'une pipette Pasteur en verre sur un bec Bunsen à créer un angle de 150 °.
  2. En utilisant une pince coupante ou une lame de rasoir, coupez soigneusement le câble optique en deux morceaux. Chaque pièce doit avoir une extrémité avec un FC / PC adaptateur et une extrémité exposée. Stocker une seule pièce comme un câble de réserve.
  3. Dénuder le câble optique vers le revêtement en enlevant la gaine de fibre et de fibres de renforcement (figure 1A) à partir de 5,0 cm de coupe d'extrémité du câble.
  4. Insérez le câble optique dans préparées pipette Pasteur. Assurez-vous que le câble peut facilement se déplacer dans et hors de la pointe de pipette.
  5. Avec le câble optique en saillie de l'extrémité de la pipette Pasteur, découpez soigneusement et retirez gaine de la fibre de partout fibre de verre, ~ 2 mm du bout coupé.
  6. L'utilisation de diamants stylo / tailleur de verre, la fibre de verre pseudo et briser off l'extrémité de créer une coupe nette / surface à l'extrémité de la fibre (figure 1B).
  7. Rentrer câble optique dans une pipette Pasteur pour le stockage. Répétez l'étape (1,6) si l'extrémité de la fibre optique se ébréchée ou les pauses de façon inégale.
  8. Position du câble optique dans une pipette Pasteur en utilisant un micromanipulateur (figure 1C).

Procédures 2-8 décrivent un procédé d'injection de transgènes dans des embryons généralement applicables aux expériences de poisson zèbre nombreux. Des variantes de cette méthode, comme celles décrites dans d'autres vidéos Jove 6, 7, 8, 9, 22 sont tout aussi efficaces.

2. Tirer aiguilles d'injection

  1. L'utilisation d'un tire-aiguille, tirez un tube de verre borosilicate en deux aiguilles d'injection avec une pointe de diminuer progressivement. Extracteur paramètres varient. (Sur un extracteur d'aiguilles Sutter Instruments, nous utilisons les paramètres: P = 500, chaleur = 720, Pull = 50, vitesse = 70 et de l'heure = 150). Chaque extracteur d'aiguilles est différent, donc d'optimiser les paramètres de traction emempiriquement. Pour plus d'aiguilles effilées, augmenter la chaleur et / ou tirer. Pour aiguilles coniques moins, augmenter le temps et / ou Pull baisse.
  2. Aiguilles Stocker dans un conteneur sécurisé (soit une boîte de Pétri avec du ruban laminé, sur le côté adhésif).

3. Verser moules d'injection

  1. Faire fondre 0,5 g d'agarose dans 30 ml d'embryon / eau bleue, jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous.
  2. Verser dans la moitié inférieure de la boîte de Pétri.
  3. Placez moule rectangulaire avec fixation puits (figure 2) en agarose, en prenant soin de limiter la formation de bulles autour des puits.
  4. Permettre d'agarose à se solidifier.
  5. Retirer du moule et remplir boîte de Pétri avec du bleu / eau embryon.
  6. Conservez-les debout, rempli avec de l'eau propre, à la température ambiante pour le jour même ou à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.

4. Assurez-Mix ADN plasmidique pour préparations injectables

  1. Diluer l'ADN plasmidique à une concentration de 50 ng / ul avec rouge de phénol à 1:10 dans ddH 2 O. Pourexemple:
    1,0 ml ADN plasmidique (250 ng / ml)
    0,5 ml rouge phénol
    3,5 ml ddH 2 O
  2. Mélange d'ADN peuvent être conservés à température ambiante si vous utilisez immédiatement ou conservés à 4 ° C pendant plusieurs jours.

5. Mettre en place paires d'accouplement

Cela devrait être fait le soir avant de vous envisagez de faire des injections.

  1. Remplir les réservoirs d'élevage avec de l'eau du système et le lieu poissons mâles et femelles ensemble. Si les injections ne peut être effectuée dès que s'allument dans l'établissement, distinct poissons mâles et femelles avec un diviseur.

6. Préparer pour préparations injectables (Peut être fait dans l'attente d'embryons)

  1. Mettez la pression d'injection plate-forme. Assurez-vous que le système est mis à pulser. Commencez par le jeu durée d'impulsion à 1.
  2. Ouvrir le robinet et AIRRégler la pression d'injection à environ 20 psi.
  3. En utilisant un microscope à dissection au plus fort grossissement, briser pointe de l'aiguille avec une pince ou un tisonnier pour créer une ouverture ~ um 2 (figure 3, Film 1).
  4. Remplir avec le mélange de l'ADN aiguilles par: 1. Placer le côté de la pointe d'aiguille, le haut, dans le mélange d'ADN et de laisser l'aiguille remplir par capillarité ou 2. En utilisant une pointe longue portée à pipeter 1-2 pl de l'ADN mélanger directement dans l'aiguille.
  5. Endroit rempli aiguille dans un endroit sûr avant d'être prêt à injecter.

7. Recueillir des embryons

  1. Après l'installation lumières ont allumé, retirez diviseurs (le cas échéant). Recueillir des embryons avec une passoire / tamis petites et les transférer sur une boîte de Pétri avec du bleu frais / eau embryon.

8. Injecter embryons au stade 1-2 cellules

  1. Transfert d'embryons récoltés pour moules d'injection en utilisant une pipette en plastique.
  2. En utilisant un microscope à dissection, poussez doucement embryons danspuits avec une pince ou un tisonnier contondant (figure 4, Film 2).
  3. Placez aiguille chargée dans un micromanipulateur et la position sur les embryons.
  4. Calibrer le volume d'injection en ajustant la durée d'impulsion de 1 par incréments jusqu'à obtenir le volume souhaité (~ 1 nl). Cela pourrait être étalonné avec un micromètre, tel que décrit dans une des vidéos précédentes Jove 8, 22, mais pour cette précision expérience n'est pas nécessaire, car un grand nombre de volumes d'injection se traduira par une expression adéquate.
  5. Injecter environ 1 nl ADN mélanger directement dans la cellule et répétez l'opération pour tous les embryons. L'ADN peut également être injecté dans le jaune, mais cela tend à être moins efficace (Figure 5, Film 3).
  6. Retirer embryons injectés de moule à l'aide d'un léger courant d'un bleu / eau embryon.
  7. Magasin injecté embryons à 28,5 ° C dans l'obscurité.
  8. Retirez non fécondés, les embryons endommagés ou morts périodiquement.
  9. Traiter embryons wie PTU entre 18-24 hpf pour prévenir la pigmentation.

9. Ecran pour l'expression du transgène

  1. Manuellement dechorionate 24-48 embryons HPF aide d'une pince.
  2. Anesthésier les larves en utilisant 0,02% tricaïne.
  3. En utilisant un microscope à fluorescence de dissection, identifier les larves avec RB ou l'expression faciale des neurones et les transférer vers un nouveau plat avec des produits frais PTU bleu / embryons eau. Embryons avec une expression rare dans les cellules facilement identifiables sont optimales, mais les neurones individuels seront ciblés pour l'activation d'un câble à fibre optique ainsi un large éventail de la densité d'expression est acceptable.
  4. Embryons Boutique à 28,5 ° C dans l'obscurité jusqu'à ce stade de l'expérimentation souhaitée.

10. Montez les larves pour les expériences de comportement

  1. Assurez 1,5% d'agarose bas point de fusion dans le trou DDH 2 O et le ranger dans un bloc de 42 ° C de chaleur pour l'empêcher de se solidifier.
  2. L'utilisation d'un pipette Pasteur en verre, le transfert de l'un des larves pré-sélectionnés dans une baignoiree de 1,5% d'agarose à bas fondue avec aussi peu bleu / embryon d'eau que possible.
  3. Transfert des larves dans une goutte d'agarose sur une petite boîte de Petri.
  4. Sous une loupe binoculaire, jusqu'à la position dorsale larve.
  5. Lorsque agarose est solidifié, couper le agarose avec une lame de rasoir mince (# 11 scalpel), en laissant un coin de la gélose autour de la larve entière.
  6. Effectuer deux coupes en diagonale de chaque côté du jaune, prenez soin de ne pas entailler la larve.
  7. Remplir la zone entourant l'embryon d'agarose / eau bleue.
  8. Tirez agarose loin du tronc et de la queue de la larve (figure 6).

11. Préparer Caméras grande vitesse et du logiciel d'imagerie

  1. Montez à haute vitesse caméra sur la dissection étendue.
  2. Connectez l'appareil photo à l'ordinateur.
  3. Allumez l'ordinateur.
  4. Allumez caméra haute vitesse.
  5. Ouvert vidéo / logiciels d'imagerie (Nous utilisons un logiciel d'imagerie AOS et décriront les procédures pour l'utiliser ici, mais d'imagerielogiciel est également acceptable).
  6. Réglez les paramètres de la caméra en conséquence (soit 1.000 images par seconde (fps), le tampon de déclenchement de 50% ou d'autres paramètres de préférence).
  7. Démarrez l'enregistrement.

12. Activer neurones unique à l'aide d'un laser nm 473

  1. Fixez stimulateur, laser et optiques.
  2. Mettez le stimulateur.
  3. Stimulateur fixé à un maximum de 5 volts et une durée d'impulsion de 5 ms.
  4. Allumez le laser selon les instructions du fabricant.
  5. Utiliser un microscope à dissection de positionner la pointe du câble optique près du corps cellulaire d'un neurone avec le chef-tdTomato expression (Figure 6).
  6. Livrer impulsion de lumière bleue pour activer des neurones sensoriels.
  7. Comportement d'enregistrement à l'aide d'une caméra à grande vitesse fixée à 500 ou 1000 images par seconde.
  8. Répétez l'expérience en tant souhaitée, attendre 1 min entre chaque activation afin d'éviter l'accoutumance. (On enregistrer au moins trois réponses pour chaque neurone).
  9. Àlarves libération, essayer de séparer les agarose avec une pince, en prenant soin de ne pas blesser l'animal. Cet animal peut être autorisé à développer davantage et la procédure peut être répétée à une ancienne étape pour caractériser le développement du comportement. L'embryon peut également être remonté à haute résolution imagerie confocale de la cellule activée pour corréler le comportement de la structure cellulaire, comme décrit ci-dessous.
  10. Transfert larve de plaque de culture avec du bleu frais / eau embryon. Nous utilisons une plaque de 24 puits de garder une trace des larves individu.

13. Image Neuron (s) avec un microscope confocal

  1. Anesthésier les larves avec 0,02% tricaïne.
  2. Larves de montage, la face dorsale en place, en 1,2% d'agarose à bas ou à l'état fondu dans un moule dorsale.
  3. Image Chef-tdTomato neurones avec un laser 543 nm et d'un filtre appropriée et objective. Nous utilisons un objectif 20x.
  4. Retirer les larves d'agarose et revenir à l'individu bien avec le bleu / eau embryon.
  5. Entreposer à 28,5 ° C dans l'obscurité pendant fuanalyse rther.

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Résultats

figure-results-1
Figure 1. Câble à fibres optiques mis en place. (A) Couches d'un câble à fibre optique. (B) câble à fibres optiques Stripped dans une pipette Pasteur. (C) Câble en fibre optique dans une pipette Pasteur positionné à l'aide d'un micromanipulateur.

figure-results-2

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Discussion

Nous avons décrit une approche pour l'activation des neurones optogenetic RB simples chez le poisson zèbre en direct. Notre méthode utilise la transgenèse transitoire pour exprimer une variante marquées par fluorescence channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, dans certains neurones somatosensoriels. Cette approche pourrait être facilement adapté pour une utilisation dans d'autres larves de poisson zèbre populations cellulaires.

En utilisant cette approche nous avons toujours o...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions Fumi Kubo, Tod Thiele et HerwigBaier (UCSF / Institut Max Planck) pour obtenir des conseils sur des expériences de comportement et DPSS laser mis en place; Heesoo Kim et Chiara Cerri du parcours de MBL Neurobiologie pour aider à Chef-tdTomato expériences; PetronellaKettunen (Université de Göteborg ) pour la collaboration initiale sur les expériences optogenetic; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike et John Milligan Baca (UCLA) pour obtenir des conseils techniques, et Roger Tsien (UCSD) pour le chef-tdTomato construire. Ce travail a été soutenu par un NRSA (5F31NS064817) prix à AMSP et une subvention de la NSF (RIG: 0819010) à l'AS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de réactif / Matériel Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
Matériels
Pipette Pasteur en verre Pêcheur 1367820B ou équivalent (10-15 mm de diamètre)
200 fibres optiques pm THORLABS AFS200/220Y-CUSTOM Cordon de brassage, Longueur: 3 m, Fin A: FC / PC, Fin B: FC / PC, Jacket: FT030
Fibre de 50 um optique THORLABS AFS50/125Y-CUSTOM Cordon de brassage, Longueur: 3 m, Fin A: FC / PC, Fin B: FC / PC, Jacket: FT030
Outil à dénuder réglable THORLABS AFS900 ou trois trous Outil à dénuder (FTS4)
Scribe Wedge diamant THORLABS S90W
Flaming / Brown Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 ou l'équivalent
Tubes en verre borosilicate avec filament Sutter Instruments BF-100-78-10
Moule d'injection n / a n / a Figure 5
Tubes de 1,5 ml à centrifuger Tout Tout
Boîte de Petri (100x15 mm) Tout Tout
Boîte de Petri (60x15 mm) Tout Tout
Pression d'injection ASI MPPI-3 ou l'équivalent
Micromanipulateur et le métal support Narashige M152 ou l'équivalent
Pipettes en plastique Fisherbrand 13-711-7 ou l'équivalent
Poker (support de broches et la broche d'insectes) Fin Sciences Tools, Inc 26018-17 26000-70 et ou l'équivalent
Forceps Fin Sciences Tools, Inc 11255-20 ou l'équivalent
Microloader pointes de pipette Eppendorf 9300001007
28,5 ° C incubateur tout tout
42 ° C bloc chauffant Tout Tout
Non stériles lames de scalpel n ° 11 Beaux-outils scientifiques, Inc 10011-00 ou l'équivalent
Dissection sfaire face Zeiss Stemi ou l'équivalent
Fluorescent microscope à dissection avec filtre standard Tout tout ou l'équivalent
Microscope confocal Zeiss LSM 510 ou 710 ou des objectifs équivalents avec des lasers pour la GFP et RFP, et 10x, 20x et 40x
Caméra à haute vitesse AOS Technologies, Inc X-PRI (130025-10) ou l'équivalent
473 nm laser portable Lasers à cristaux CL-473-050 ou plus de puissance, avec l'option TTL
S48 Stimulator Astro-Med, Inc division Grass Instrument S48K ou l'équivalent
FC / PC pour manchon d'accouplement FC / PC THORLABS ADAFC1 Mai need pour le raccordement du câble optique
Lunettes de sécurité laser THORLABS LG10 ou l'équivalent
24 plaques de culture Genesee 25-102 ou l'équivalent
Diapositives dépression simples Pêcheur S175201 Ou équivalent
Réactif
Instant Ocean Les écosystèmes aquatiques IS50
Le bleu de méthylène Pêcheur S71325
Rouge de phénol Sigma P4758
Agarose EMD 2125 ou l'équivalent
Low Melt agarose Sigma A9045 ou équivalent
PTU Sigma P7629
Tricaïne Sigma A5040
eau bleu / embryon 10 L ddH 2 O
0,6 g Instant Ocean
6 gouttes de méthylène bleu
rouge phénol (5 mg / ml dans 0,2 M KCl)
100x PTU 0,150 g PTU
50 ml ddH 2 O
dissoudre à 70 ° C, agiter souvent
aliquote et conserver à -20 ° C
1x PTU 1 ml 100x PTU
99 ml bleu / poissons d'eau
Tricaïne solution mère 400 mg tricaïne
97,9 ddH 2 O
~ 2,1 ml Tris 1 M, pH 9,0 ajuster le pH à ~ 7,0
magasin à 4 ° C ou à -20 ° C pour le stockage à long terme

Références

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