Outils optogenetic génétiquement codés permettent une manipulation non invasive des neurones spécifiques dans le Drosophila Cerveau. Ces outils peuvent identifier les neurones dont l'activation est suffisante pour déclencher ou supprimer des comportements particuliers. Nous présentons ici une méthode pour activer Channelrhodopsin2 qui est exprimé dans les neurones ciblés chez les mouches librement à pied.
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Article de méthode
Stimulation optogenetic de comportement de fuite en
Dans cet article
Résumé
Résumé
Un nombre croissant d'outils codés génétiquement sont désormais disponibles qui permettent une manipulation non invasive de l'activité nerveuse des neurones spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Parmi ceux-ci sont des outils qui permettent optogenetic, l'activation ou inactivation des neurones spécifiques chez l'animal intact et se déplacer librement en utilisant une lumière vive. Channelrhodopsin (ChR2) est un canal cationique activé par la lumière qui, lorsqu'il est activé par la lumière bleue, provoque une dépolarisation des neurones qui l'expriment. ChR2 a été efficace pour identifier les neurones essentiels à des comportements spécifiques, tels que le CO 2 d'évitement, extension du proboscis et le géant en fibre de réaction de sursaut médiation 2-4. Cependant, comme les sources lumineuses intenses utilisées pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, ces techniques optogenetic n'ont pas déjà été utilisé dans le système visuel. Ici, nous combinons une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction à la démonstrate que l'activation d'un groupe de métier à tisser les neurones sensibles à lobe optique de la mouche, Foma-1 neurones, peut entraîner un comportement de fuite permet d'éviter une collision. Nous avons utilisé un allèle nul d'une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β, codée par le gène NORPA, pour rendre les mouches aveugles et également utiliser le Gal4-UAS système activateur de la transcription pour diriger l'expression de ChR2 dans le Foma-1 neurones. Mouches individuels sont placés sur une petite plate-forme entourée de LED bleues. Lorsque les voyants sont allumés, la vole vite décoller en vol, d'une manière similaire à visuellement conduit métier-évasion comportement. Nous pensons que cette technique peut être facilement adapté à examiner les comportements des autres en se déplaçant librement mouches.
Introduction
Un arsenal de plus en plus d'outils génétiquement codés ont été développés pour manipuler l'activité neuronale dans des cellules spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Ces outils permettent l'activation non invasive ou réprimer des neurones spécifiques chez l'animal intact et libre de ses mouvements. Parmi ceux-ci, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal cationique activé par la lumière, offre des avantages importants, car il peut être contrôlé dans le temps et rapidement induite. Lorsque les neurones qui expriment ChR2 sont exposés à bleu clair (470 nm) ont rapidement dépolariser et présentent des taux élevés de tir 3-5. Une telle activation ciblée des neurones spécifiques chez les animaux se déplaçant librement a révélé le caractère suffisant des neurones particuliers pour des comportements tels que le CO 2 d'évitement 3, trompe l'extension 2,4, et le géant en fibre de réactions effarouchées médiation 4. Cependant, les sources intenses de lumière nécessaires pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, en appliquant optogenetic techniques du système visuel a été limité. En combinant une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction, nous avons démontré que l'activation d'un ensemble spécifique de neurones du lobe optique de la mouche peut conduire le comportement de fuite utilisé pour éviter la collision 6.
La plupart, sinon la totalité, des animaux visuels présentent un comportement de fuite pour éviter les collisions avec des objets venant en sens inverse. La marche ou arrêt mouches, lorsqu'ils sont présentés avec une collision imminente, le décollage en vol, loin de la collision venant en sens inverse 7-9. Ces décollages sont caractérisés par des ailes soulevées avant le décollage et une trajectoire de vol instable 10,11. Cette réponse est distinct du géant en fibre de réaction de sursaut médiation, sauts qui ne sont pas précédés par des ailes soulevées, et le plus souvent se traduire par une chute en chute libre 4,9. Après avoir identifié un ensemble spécifique de neurones sensibles métier dans le lobe optique, Foma-1 neurones, qui sont uniquely accordé à coder des objets approchant, nous avons cherché à sonder leur implication dans le comportement de la mouche métier évasion. Ici, nous démontrons l'utilisation de optogénétique pour activer sélectivement les neurones et susciter des comportements d'évasion de la mouche.
Nous utilisons le système de Gal4-UAS activateur transcriptionnel pour diriger l'expression de ChR2 dans les Foma-1 neurones. ChR2 nécessite le cofacteur tout-trans-rétinal et comme cela se trouve dans des niveaux faibles dans le système nerveux central chez la drosophile elle doit être complétée dans le régime alimentaire des mouches. 3,4 Comme la lumière vive est utilisée pour activer ChR2 et les mouches des comportements phototactiques forts 12, nous avons cherché à éliminer la possibilité d'une réponse visuelle au stimulus. Pour ce faire, nous avons utilisé les animaux qui étaient mutant homozygote pour un allèle nul du gène NORPA, qui code pour une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β. Photorécepteurs de ces mouches mutantes sont incapables de responsabilitéd à la lumière 13. Pour tester la stimulation de la réponse optogenetic évasion, nous avons besoin d'isoler une seule mouche et se baigner dans la lumière bleue brillante. Pour ce faire, nous plaçons les mouches individuelles dans les embouts de pipettes. Un embout de la pipette est placé dans un support personnalisé, tel que la mouche geotactically marcher sur la pointe et sur une plate-forme rectangulaire. La mouche est capable de se promener librement autour de la partie supérieure de cette plate-forme. La plate-forme est entourée de quatre rangées de LED bleues, chacune contenant 3 LED, axés sur le dessus de la plate-forme. Après la mouche est sur la plate-forme, les LED sont allumées, et la réponse de la mouche est enregistrée à l'aide d'une caméra grande vitesse 6.
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Protocole
1. Générer mouches channelrhodopsin
- Croix SAMU-CHR2 mouches avec le pilote Gal4 de votre choix, nous utilisons G105-Gal4, qui est exprimée dans Foma-1 neurones dans le lobe optique.
- Pour éliminer la possibilité d'une réponse à la stimulation visuelle bleu clair, les deux lignes de vol sont en aw + NORPA arrière-plan.
- Résultat final: w + NORPA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Après mouches adultes éclosent, mis femelles sélectionnées sur les produits frais, complété avec 10 uM tout-trans-rétiniennes (un co-facteur nécessaire à la ChR2) et à l'abri de la lumière, pendant 3 jours avant d'effectuer le test comportemental.
2. Faire 10 uM tout-trans-rétinal alimentaire améliorée
- Dissoudre 100 mg de tout-trans-rétinal dans 17,6 ml d'éthanol à 95% à 20 mM faire rétinienne. Gardez tout-trans-rétinal abri de la lumière à tout moment.
- Faire fondre norme alimentaire mouche semoule de maïs au micro-ondes et laisser refroidir jusqu'à ce que chaud au toucher.
- Mélanger 50 ul de 20 mMtout-trans-rétinal dans des flacons de 10 ml de nourriture volée.
- Laissez refroidir et conserver les flacons abri de la lumière.
3. Équipement
- Embouts de pipette: Standard 1.000 embouts de pipette ul sont coupées près de la pointe, la création d'un diamètre de pore d'environ 2,25 mm.
- Plate-forme (voir figure 1).
- Une base de Delrin, 17 cm x 25 cm, a été construit avec des trous filetés à chaque coin pour s'adapter ¼ "NPT raccords de tuyaux de liquide de refroidissement.
- Un support vertical, fait en Delrin, est fixé au centre de la base. Les dimensions hors tout de 25 mm X 40 mm X 65 mm (largeur x profondeur x hauteur). Une rainure 10 mm de largeur s'étend sur la longueur du support, avec une vis de serrage à la base. Une plate-forme est fixée à la partie supérieure du support, 25 mm X 40 mm X 10 mm, avec un trou de 3,5 mm de diamètre alignée avec la rainure dans le support.
- Tableaux à LED (voir Figure 1).
- Quatre bras de tuyau de réfrigérant, ~ 18 cm de long, sont fixés à la plate-forme base en utilisant le raccord de tuyau de liquide de refroidissement. Tuyau de refroidissement est utilisé seulement comme un soutien structurel et n'est pas utilisé à des fins de refroidissement.
- Rainures espacées correctement sont découpées dans la dernière pièce du liquide de refroidissement arrosage de chaque bras pour fixer un dissipateur de chaleur à l'extrémité de chaque bras.
- A Rebel LED bleue Tri-étoiles est monté à chaque puits de chaleur à l'aide de pré-découpe du ruban adhésif thermique. A 18 ° Carclo Tri-lentille est apposée sur chaque Tri Star-.
- LED Tri-Stars sont raccordés aux conducteurs BuckPuck DC et une alimentation électrique comme indiqué. Nous avons organisé notre set-up avec chaque BuckPuck alimenter deux Tri-étoiles en série.
- Illumination des quatre LED Tri-étoiles de 700 mA a donné un rayonnement de 713 W / m 2 sur notre plateforme.
- Appareil photo: L'appareil est monté sur un trépied de petite et axée sur le dessus de la plate-forme.
4. Essai de comportement
- En bref anesthésier les mouches sur de la glace.
- Placez les mouches individuelles dans les embouts de pipettes, avec du ruban adhésif pour fermerles deux extrémités de la pointe.
- Après les mouches se sont réveillés et sont activement explorer la pointe de la pipette, retirez la bande et placez une pipette dans la rainure dans le support vertical. La vis est utilisé pour sécuriser la pointe de la pipette en place et de fermer le fond de la pointe.
- Comme la mouche explore la pointe de la pipette (typiquement 30 - 60 sec), démarrez l'enregistrement de la caméra juste avant la mouche sort de l'embout sur la plate-forme.
- Après la mouche a émergé sur la plate-forme, attendez 1-2 seco, et allumez la diode bleue. Utilisez une minuterie pour mesurer manuellement le temps jusqu'à ce que la mouche initie vol.
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Résultats
Aveugle vole exprimant son ChR2 ou le pilote G105 eux seuls montrent un faible taux de décollage après leur illumination avec une lumière bleu vif. Aveugle vole présentait le même taux de décollage quel que soit l'éclairage (Figure 2), ce qui suggère que ces décollages étaient spontanées plutôt qu'à cause de l'éclairage avec la lumière bleue. Lorsque le ChR2 est exprimé dans les neurones Foma1, cependant, l'illumination avec de la lumière bleue provoque la réaction de fuite. Plus de 50% ...
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Discussion
Nous avons démontré une stimulation optogenetic des comportements de fuite en se baignant librement marcher mouches dans la lumière bleue brillante. Cette approche peut être facilement adaptée à examiner les comportements des autres mouches librement à pied, et peut être adapté aux grandes plates-formes par un simple carrelage des réseaux de DEL, nous avons utilisé sur une grande surface. En utilisant soit la caméra bon marché, nous décrivons, ou d'autres systèmes de caméras disponibles, l'utilisateur peut...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été financé par une bourse de Dean Stanford (SEJdV), un National Institutes of Pioneer Award directeur de la santé (TRC DP0035350), le Prix de la Fondation McKnight Scholar de (TRC) et R01 EY022638 (TRC).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif | |||
| Tout-trans Retinal | Les progrès scientifiques et Chemical Inc | R3041 | |
| Équipement | |||
| Dissipateur thermique 9.2 C / W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm carré X 30 mm de hauteur |
| 18 ° Carclo Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Rebel LED bleue sur Tri-Star de base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA DC BuckPuck pilote | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| Faisceau de câblage pour le pilote BuckPuck | Luxeonstar | 3021-SE | |
| Pré-coupe du ruban adhésif thermique | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 Base mm Hex |
| Tuyau de liquide de refroidissement Snap-Loc, ¼ "ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Connecteur de tuyau de liquide de refroidissement | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼ "NPT mâle |
| Laboratoire de grade mode de commutation programmable Alimentation DC | BK Precision | 1698 | |
| Exilim caméra | Casio | EX-FH20 |
Références
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
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- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O'Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
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- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
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Réimpressions et autorisations
