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Article de méthode

Marquage métabolique de l'ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d'expression génique de l'ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

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DOI :

10.3791/50195

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8 août 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L'ARN cellulaire total donne un mauvais modèle pour l'étude des changements à court terme dans la synthèse d'ARN et de la décomposition ainsi que les cinétiques de maturation de l'ARN. Ici, nous décrivons marquage métabolique des ARN transcrits récemment avec 4 thiouridine suivie par biotinylation et purification thiol-spécifique des ARN transcrits nouvellement permettant de surmonter ces limitations.

Résumé

Le développement de puces tout-transcriptome et le séquençage de prochaine génération a révolutionné notre compréhension de la complexité de l'expression des gènes cellulaires. Avec une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués, des mesures précises de la cinétique sous-jacents sont devenus de plus en plus importante. Ici, ces méthodes puissantes font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques des échantillons de modèle à savoir l'étude des ARN cellulaires, ils totales. Dans de nombreux cas, des changements dans l'ARN cellulaire total surviennent trop lentement ou trop rapidement pour représenter les événements moléculaires sous-jacents et leur cinétique avec une résolution suffisante. En outre, la contribution des altérations de la synthèse de l'ARN, le traitement et la décadence sont pas facilement différencié.

Nous avons récemment développé à haute résolution de l'expression génique pour surmonter ces limitations. Notre approche est basée sur le marquage métabolique de l'ARN nouvellement transcrit avec 4 thiouridine (donc également dénommé 4SU-marquage) suivie d'une purification rigoureuse de l'ARN transcrit à l'aide de nouveaux biotinylation thiol-spécifique et des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Il est applicable à un large éventail d'organismes, y compris les vertébrés, chez la drosophile et la levure. Nous avons appliqué avec succès 4SU-tagging pour étudier la cinétique en temps réel des activités de facteurs de transcription, fournir des mesures précises de l'ARN demi-vie, et obtenir de nouveaux aperçus sur les cinétiques de maturation de l'ARN. Enfin, la modélisation computationnelle peut être utilisée pour générer une analyse globale et intégrée des mécanismes moléculaires sous-jacents.

Introduction

Profil d'expression génique est un outil clé utilisé pour étudier les processus cellulaires et le réseau d'interaction complexe associé. Des études sur l'abondance de l'ARNm ont généralement été la méthode de choix pour obtenir un aperçu de base sur les mécanismes moléculaires sous-jacents. Le développement de puces tout-transcriptome 1 et, plus récemment, le séquençage de prochaine génération de l'ARN (RNA-Seq) 2-4 alimentée cette approche. Bien que ces technologies ont révolutionné notre compréhension de la complexité de l'expression du gène cellulaire, ils font face à des limitations dues aux propriétés intrinsèques de leur échantillon de modèle, à savoir l'ARN cellulaire total. Premiers changements à court terme des niveaux d'ARN totaux ne correspondent pas à l'évolution des taux de transcription, mais sont intrinsèquement dépendante de l'ARN demi-vie des transcriptions respectifs. Alors qu'une induction cinq fois d'une transcription, par exemple l'encodage de courte durée pour un facteur de transcription, sera facilement détectable dans l'ARN totalmoins d'une heure, le même induction de la transcription, par exemple l'encodage de longue durée pour une enzyme métabolique, restera pratiquement invisible. En outre, même un arrêt complet (> 1000 fois down-regulation) du taux de transcription d'un gène moyenne avec un ARN demi-vie de cinq heures seront simplement prendre cinq heures pour les niveaux d'ARN totaux diminuer de seulement double . Par conséquent, l'analyse de l'ARN totale favorise la détection d'une régulation de la transcription de courte durée, dont la plupart codent pour des facteurs de transcription et des gènes avec des fonctions de réglementation 5. En outre, la vraie cascade cinétique de la réglementation est obscurcie et événements de signalisation primaires ne peut être différenciée du secondaire. Les deux, à son tour, peut entraîner un biais important dans les analyses bioinformatiques aval. Deuxièmement, des modifications dans les niveaux d'ARN totaux ne peuvent pas être attribuées à des changements dans la synthèse d'ARN ou de pourriture. Les mesures de ce dernier nécessitent des approches invasives cellulaires, par exemple blocage transcriptisur l'utilisation de l'actinomycine D 6, et la surveillance prolongée de l'ARN décroissance continue au fil du temps. Avec un ARNm demi-vie moyenne dans les cellules de mammifères de 5 à 10 hr 5,7, les niveaux d'ARNm de la plupart des gènes seulement auront diminué de moins de double après plusieurs heures d'arrêt de la transcription. Ces plutôt petites différences se traduisent en mesures grossièrement imprécise des demi-vies d'ARNm pour la majorité des gènes cellulaires en raison de la nature exponentielle des équations mathématiques sous-jacents. Enfin, si l'ARN-seq de l'ARN cellulaire total a révélé que près de la moitié de nos gènes sont soumis à des événements d'épissage alternatifs 8, la cinétique sous-jacents ainsi que les mécanismes dynamiques directeurs tissus et spécifiques au contexte réglementaire de traitement de l'ARN restent mal compris. En outre, la contribution de l'ARN traitement à l'expression différentielle des gènes, en particulier pour les ARN non-codants, reste à déterminer. Au total, ces limitations représentent des obstacles majeurs pourmodélisation cinétique bioinformatique des mécanismes moléculaires sous-jacents.

Nous avons récemment développé une approche, appelée résolution gène profilage de haute expression, pour surmonter ces problèmes 5,7,9. Il est basé sur le marquage métabolique de l'ARN nouvellement transcrit en utilisant 4 thiouridine (4SU-tagging), un dérivé de l'uridine naturel, et offre un accès direct aux transcriptions nouvellement transcrites avec un minimum d'interférences dans la croissance cellulaire et l'expression des gènes (voir Figure 1) 5, 10-12. L'exposition des cellules eucaryotes aux résultats 4SU à son adoption rapide, la phosphorylation de 4SU-triphosphate, et incorporation dans l'ARN nouvellement transcrites. Après isolement de l'ARN cellulaire total, la fraction d'ARN 4SU-marqué est thiol-spécifique biotinylé à générer un pont disulfure entre la biotine et l'ARN nouvellement transcrites. 'ARN cellulaire total »peuvent ensuite être séparés quantitativement dans étiqueté (' nouvellement transcrit») et sans étiquette («pré-existinG ') d'ARN avec une grande pureté en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine. Enfin, l'ARN marqué est récupéré à partir des billes par simple addition d'un agent réducteur (par exemple le dithiothréitol) le clivage de la liaison disulfure et de libérer l'ARN nouvellement transcrites à partir des billes.

ARN nouvellement transcrit représente l'activité de transcription de chaque gène au cours de la période d'exposition 4SU. 4SU-tagging dans le calendrier de minutes fournit ainsi un instantané de l'expression des gènes eucaryotes et un modèle idéal pour les analyses bioinformatiques en aval (par exemple, l'analyse du promoteur). Dans les cas où l'état d'équilibre peut supposer, les ratios de nouveaux transcrits / total, nouvellement transcrites / non étiquetés et non étiquetés / ARN total fournissent un accès non-invasive à l'ARN précises des demi-vies 7,13. En outre, il est important de noter que les ARN transcrits nouvellement purifié après aussi peu que 5 min de 4SU-tagging (5 min 4SU-ARN) est plus jeune que 15 et 60 min 4SU-ARN.Lorsque vous effectuez à la fois ultra-court et progressivement plus 4SU-tagging dans un cadre expérimental unique combiné avec l'ARN-Seq, la cinétique de maturation de l'ARN sont révélés à la résolution de nucléotides 9. Enfin, les analyses temps-cours d'ARN nouvellement transcrites et total combiné avec la modélisation informatique permettent une analyse intégrative de la synthèse de l'ARN et de la décomposition 14.

En conclusion, cette approche permet l'analyse directe de la dynamique de la synthèse d'ARN, de la transformation et de la dégradation dans les cellules eucaryotes. Elle est applicable dans tous les grands organismes modèles y compris des mammifères, des insectes (drosophile), les amphibiens (Xenopus) et la levure 5,15,16. Il est directement compatible avec l'analyse des microréseaux 5,17, RNA-Seq 9,13,14, et est applicable in vivo 12,15. Ici, nous détaillons la méthodologie d'étiqueter, d'isoler et de purifier l'ARN nouvellement transcrites dans les cellules de mammifères en culture. En outre, potentiomètreproblèmes al et les pièges sont discutées.

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Protocole

1. Marquage métabolique avec 4 thiouridine

Faire un plan détaillé du dispositif expérimental / calendrier, par exemple quand il faut ajouter le 4SU à la culture cellulaire et quand récolter des échantillons. Régime pendant au moins 5 minutes entre chaque état. Ne traiter que des cellules d'un état à la fois. Poignée max. 3-5 plats à un moment donné. Manipuler les cellules aussi rapidement que possible pour minimiser les changements dans 2 niveaux de température et CO. Évitez d'exposer les cellules à la lumière après 4SU est ajouté, car cela pourrait conduire à une réticulation de l'ARN 4SU marquées par des protéines cellulaires.

Début de l'étiquetage

  1. Dégel 4 thiouridine (4SU) juste avant l'utilisation et la pipette quantité requise de 4SU pour chaque état dans un tube Falcon stérile.
  2. Prenez le montant requis de milieu de culture cellulaire (5 ml par boîte de 10 cm) sur les assiettes et ajouter à tube Falcon 4SU contenant et bien mélanger. Retirez et jetez le milieu restant de la vaisselle.
  3. Appliquer 4SU contenant dossier moyen pour les plats.

Fin de l'étiquetage

  1. Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir de cellules. Ajouter 5 ml de Trizol à chaque plaque. Pour les expériences complexes incluant plusieurs points dans le temps ou des conditions, cette étape est mieux fait par deux personnes, une élimination du milieu, l'autre ajoutant Trizol et la récolte du lysat.
  2. Incuber pendant 5 min à la température ambiante pendant une lyse complète des cellules.
  3. Utiliser une pipette de 10 ml de rincer soigneusement la plaque avec le Trizol ajouté. Ceci facilite la lyse complète des cellules et la récupération de l'échantillon. Manipuler avec soin comme Trizol est extrêmement dangereux quand entrer en contact avec la peau ou les yeux! Avoir antidote pour les brûlures phénol à la main (par exemple le polyéthylène glycol 300 ou 400 dans l'alcool dénaturé industriel (70:30)). Transférer les échantillons dans des tubes en polypropylène. Veuillez noter que les tubes Falcon classiques ne résistent pas à ces grandes forces G). Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins un mois avant l'ARN total is préparé.

2. Préparation d'ARN utilisant protocole modifié Trizol

  1. Ajouter 1 ml de chloroforme (0,2 ml par ml Trizol) et agiter vigoureusement pendant 15 secondes. Incuber à température ambiante pendant 2 - 3 min.
  2. Centrifuger à 13000 g pendant 15 min à 4 ° C.
  3. Transférer la phase supérieure aqueuse (contenant de l'ARN) à un nouveau tube en polypropylène de 15 ml.
  4. Ajouter la moitié du volume de la réaction de précipitation à la fois un tampon d'ARN et de l'isopropanol (par exemple de 3 ml de surnageant ajouter 1,5 ml de tampon d'ARN précipitation et de 1,5 ml d'isopropanol).
  5. Mélangez bien. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  6. Centrifuger à 13000 g pendant 10 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant.
  7. Centrifuger brièvement (5000 g pendant 30 sec) et retirer l'isopropanol résiduel avec pipette 200 pl.
  8. Ajouter un volume égal d'éthanol à 75% et agiter le tube jusqu'à ce que le culot se détache. Évitez le divisant en plusieurs petits morceaux comme cela peut rendre l'enlèvement de résidusl d'éthanol difficile.
  9. Centrifuger à 13000 g pendant 10 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant.
  10. Isoler ARN brièvement et éliminer l'éthanol restant avec une pipette 200 pl. Répétez l'étape et éliminer l'éthanol restant avec une pipette 20 ul. Après ces deux étapes, aucune autre séchage du culot doivent être effectuées.
  11. Ajouter 100 ul de H 2 O par 100 ug de rendement en ARN attendu et bien mélanger par pipetage de haut en bas 5-6 fois pour aider à dissoudre l'ARN.
  12. Dissoudre et dénaturer l'ARN par chauffage à 65 ° C pendant 10 min (shaker) et placer immédiatement sur la glace.
  13. Mesurer l'ARN concentration à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop, suivant les instructions du fabricant. Cet ARN peut être conservé à -80 ° C pendant au moins un mois.

3. Biotinylation thiol-spécifique de l'ARN récemment transcrits

  1. Commencez avec 60 à 80 ug d'ARN cellulaire total.
  2. Constituer étiquetage réaction. Pipette dans la suiteordre (ARN par ug d'):
    1. 1 pl de tampon de Biotinylation 10x
    2. 7 ARN ul (contenant 1 ug d'ARN dilués dans nucléase H 2 O)
    3. 2 pl biotine HPDP (1 mg / ml DMF)

Toujours ajouter la biotine HPDP dernier et mélanger immédiatement par pipetage. Dans le cas où la biotine précipite, contenu DMF peut être augmentée jusqu'à une concentration finale de 40%.

  1. Incuber à température ambiante pendant 1,5 heures avec rotation.
  2. Ajouter un volume égal de chloroforme. Mélanger vigoureusement. Incuber pendant 2-3 minutes jusqu'à ce que les phases commencent à se séparer et les bulles commencent à disparaître.
  3. Centrifuger à 20000 g pendant 5 min à 4 ° C. Soigneusement transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
  4. Répétez les étapes 3,4 et 3,5 fois. Vous pouvez effectuer cette opération dans 2 ml à verrouillage de phase gel tubes lourds pour réduire la perte de l'ARN.
  5. ARN précipitations: ajouter 1/10 du volume de 5 M de NaCl et un volume égal d'l'isopropanol à la phase aqueuse.
  6. Centrifuger à 20000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant.
  7. Ajouter un volume égal d'éthanol à 75%, centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant.
  8. Centrifuger brièvement et enlever des résidus d'éthanol avec 200 pipette ul.
  9. Centrifuger brièvement et enlever des résidus d'éthanol avec 20 pipette ul.
  10. Ne laissez pas l'ARN à sécher. Re-suspendre en 50 - 100 pi H 2 O (~ 1 pi par 1 ug d'ARN d'entrée). Bien mélanger par pipetage de haut en bas 5 - 6 fois.
  11. Vérifiez la qualité de l'ARN par analyse électrophorétique d'exclure dégradation de l'ARN.

4. Dot Blot Analyse des 4SU-incorporation (Facultatif)

Incorporation 4SU peut être facilement déterminée par analyse dot blot d'ARN biotinylé. Il s'agit d'une étape facultative qui permet le dépannage et l'estimation des taux d'incorporation 4SU rapport à un témoin oligo d'ADN biotinylé. Pour ce test nous avons recommend utilisant iodoacétyle-biotine au lieu de biotine HPDP pour biotinylation de l'ARN 4SU marqués à l'étape 3.2. Il en résulte une biotinylation irréversible de 4SU-ARN. Par conséquent, les méthodes basées sur colonne (par exemple RNeasy) peuvent être utilisés pour la récupération de plus petites quantités d'ARN biotinylé (par exemple 5 ug). Alors que l'ARN biotinylé en utilisant la biotine HPDP est également approprié pour cet essai, le signal résultant est plus faible et le rapport signal-bruit moins favorable (Figure 3).

  1. Suivre le protocole de 4SU-étiquetage et l'isolement de l'ARN cellulaire total, comme décrit dans les sections 1 et 2.
  2. Biotinyler 4SU-ARN marqué comme décrit dans la section 3, en remplaçant la biotine HPDP avec iodoacétyle-biotine et d'effectuer deux extractions chloroforme pour éliminer complètement les résidus iodoacétyle-biotine excessifs.
  3. Récupérer ARN biotinylé par isopropanol / éthanol précipitation comme décrit ou en utilisant une approche basée sur les colonnes (par exemple RNeasy) en cas de petites quantités d'ARN (<10 pg) Sont utilisés.
  4. Incuber la membrane Zeta dans l'eau sans nucléase à bascule pour 10 min.
  5. Prendre la membrane hors de l'eau sans nucléase et retirer les fluides excessifs en plaçant la membrane entre deux serviettes en papier propre et en appuyant fermement. Air-séchage de la membrane pendant 5 min se traduira par des points plus agréables.
  6. Pour chaque échantillon, préparer 20 pi d'ARN 200 ng / ul utilisant glacée tampon de liaison dot blot (NaOH 10 mM, EDTA 1 mM). Appliquer 5 ul de cette dilution (soit 1 ug d'ARN), ainsi que trois dilutions de 10 fois suivantes (soit 100, 10 et 1 ng d'ARN, respectivement) de la membrane Zeta par pipetage. Pipetage à travers un rack vide de pointes de pipette peut être utilisé pour fournir espacement uniformément répartie. Sinon, utilisez un appareil de dot blot selon les instructions du fabricant.
  7. Appliquer 5 pl de l'ADN oligo marqué à la biotine à des concentrations allant de 20 ng / ul à 20 pg / pl (soit 100, à 0,1 ng oligo) comme une suite favorablerol à la membrane par pipetage. Utilisez un échantillon biotinylé, 4SU naïfs comme contrôle négatif.
  8. Air-sécher la membrane pendant 5 min.
  9. Incuber la membrane pendant 30 min à 40 ml avec un tampon de blocage à bascule.
  10. Incuber la membrane avec 10 ml de 1:1000 streptavidine-peroxydase de raifort pendant 15 min (5 ml de PBS + 5 ml SDS 20% + 10 pl streptavidine-peroxydase de raifort)
  11. Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) pendant 5 min.
  12. Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) pendant 5 min.
  13. Lavez membrane deux fois dans 40 ml de PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 pi 20% SDS) pendant 5 min.
  14. Retirer un excès de liquide en plaçant la membrane entre deux serviettes en papier propre et en appuyant sur les fermement.
  15. Visualisez membrane-bound HRP en utilisant ECL selon les instructions du fabricant.
  16. Placer la membrane dans du papier / sac en plastique, enlever les bulles d'air et incuber pendant 2 min dans l'obscurité.
  17. Exposer la membrane àfilm 1 - 5 min.

5. Séparation de l'ARN étiquetés et non étiquetés en utilisant des billes magnétiques revêtues de streptavidine

  1. La chaleur du tampon de lavage (3 ml par exemple) à 65 ° C dans un bain d'eau.
  2. Préparer une solution fraîche mM dithiothréitol 100 (DTT) dans nucléase H 2 O. Le faire par décantation de 15 à 30 mg de poudre de TNT dans un tube propre de 50 ml Falcon placé sur l'ultra-fine échelle. Peser et ajouter la quantité requise de nucléase H 2 O.
  3. Heat biotinylé échantillons d'ARN à 65 ° C pendant 10 min pour dénaturer et immédiatement sur la glace.
  4. Lieu μMacs colonnes dans le support magnétique. Nous vous recommandons de ne pas traiter plus de 12 échantillons à la fois (6 - 8 échantillons sont optimales).
  5. Miltenyi colonnes pré-s'équilibrer avec la température ambiante 1 ml de tampon de lavage. Cela prendra environ 15 minutes.
  6. Pendant ce temps, ajouter 100 ul de billes de streptavidine à 50 - 100 ul d'ARN biotinylé. Incuber à température ambiante pendant 15 min avec rotation.
    7. < li> Si l'une des colonnes n'a pas engagé de vidange maintenant ce qui peut être facilité en appuyant doucement sur le haut de la colonne avec un doigt ganté. Une fois que le flux a commencé les colonnes drainent facilement.
  7. Appliquer les ARN / perles pour les colonnes. Jeter l'effluent à travers, sauf si vous voulez récupérer la fraction d'ARN sans étiquette (voir section 7).
  8. Laver trois fois avec 0,9 ml de 65 ° C tampon de lavage (1 ml pointes de pipette rétrécissent quand pipetage tampons à 65 ° C).
  9. Laver trois fois avec 0,9 température ambiante ml du tampon de lavage.
  10. Pipette 700 ul de tampon RLT (RNeasy Kit de nettoyage de MinElute, Qiagen) dans de nouveaux tubes de 2 ml et de les placer sous les colonnes.
  11. On élue l'ARN nouvellement transcrites dans le tampon RLT en ajoutant 100 ul de 100 mM DTT aux colonnes.
  12. Effectuer un deuxième tour élution 3 min plus tard dans le même tube en ajoutant un autre 100 pi de DTT 100 mM.

6. La récupération de l'ARN récemment transcrits

ontenu "> Continuer avec le nettoyage de MinElute RNeasy (Qiagen) protocole suivant les instructions du fabricant. Elute dans 25 pi H 2 concentrations d'ARN Mesure O. nucléase aide d'un spectrophotomètre Nanodrop. Pour éviter d'avoir à décongeler et recongeler ARN avant de soumettre à un dosage à haut débit, nous vous recommandons la préparation d'ADNc immédiatement après l'ARN nouvellement transcrit est purifié. Utiliser 2,5 pi de l'ARN nouvellement transcrites dans 20 pi de mélange de synthèse d'ADNc pour la synthèse d'ADNc en suivant les instructions du fabricant. effectuer des contrôles qRT-PCR en utilisant 1 : 10 dilutions du mélange d'ADNc magasin ARN à -80 ° C..

7. Récupération de vierge, Unbound ARN (Facultatif)

Dans le cas où l'ARN non lié doit être récupéré; recueillir et combiner l'écoulement traversant (après addition de la solution de billes ARN-streptavidine pour les colonnes) et du premier lavage pour la précipitation subséquente. Habituellement, il est suffisante pour précipiter seulement 50% de l'ARN non lié comme this contiendra> 80% de la matière de départ.

  1. Ajouter un volume égal d'isopropanol (pas de sel doit être ajoutée comme le tampon de lavage contenant déjà 1 M de NaCl).
  2. Centrifuger à 20000 g pendant 20 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant.
  3. Ajouter un volume égal d'éthanol à 75%, centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant.
  4. Centrifuger brièvement et enlever des résidus d'éthanol avec 200 pipette ul.
  5. Centrifuger brièvement et enlever des résidus d'éthanol avec 20 pipette ul.
  6. Ne laissez pas l'ARN à sécher. Remettre en suspension dans 100 ul H 2 O. Bien mélanger par pipetage de haut en bas 5 - 6 fois. Incuber à 65 ° C pendant 10 min avec agitation et transférer directement à la glace.
  7. Vérifiez la qualité de l'ARN par analyse électrophorétique d'exclure dégradation de l'ARN.

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Résultats

1. Matériau de départ et rendements attendus

Après 1 heure (h) de 4SU-exposition ARN nouvellement transcrit représente environ 1-4% de l'ARN cellulaire total. Ce sera plus faible dans les cellules de la croissance arrêtés car ils ne synthétisent l'ARN pour tenir compte de la croissance / réplication cellulaire. Lors de l'étiquetage pendant 1 heure, nous vous conseillons de commencer le dosage avec 60 à 80 ug d'ARN total. A partir de moins de 30 ug de l'ensemble des résultats...

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Discussion

Le marquage métabolique de l'ARN transcrit nouvellement renforce considérablement la puissance des technologies à haut débit comme des puces et ARN-Seq en fournissant des modèles plus appropriés pour aborder la question biologique d'intérêt. Le présent protocole a subi une optimisation considérable. Il permet l'enrichissement> 1000 fois de l'ARN nouvellement transcrites et fournit des résultats hautement reproductibles.

Le dispositif expérimental d'une expérience 4SU-t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Nous tenons à remercier Amie Regan pour la lecture attentive du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NGFN plus de subvention # 01GS0801, MRC bourse subvention G1002523 et NHSBT subvention WP11-05 à LD et DFG subvention FR2938/1-1 au CCF

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-thiouridineCarbosynthT4509Préparer un stock de 50 mM dans du H2O stérile, conserver à -20 ° ; C dans des aliquotes de 50-500 &mu ; l, jeter le réactif non utilisé, ne pas recongeler.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)AVERTISSEMENT - CORROSIF et DANGEREUX POUR LA SANTÉ ! Assurez-vous d’un accès immédiat à l’antidote phénolique (PEG-Méthanol) ; Conserver à 4 °C.
ChloroformeSigma372978AVERTISSEMENT - DANGEREUX POUR LA SANTÉ
IsopropanolSigma650447
Citrate de sodium, sans nucléaseSigmaC8532Préparez une solution mère de 1,6 M en utilisant de l’eau sans nucléases.
5M sans nucléases NaClSigma71386Solution mère
Sans nucléases H2OSigmaW4502Faire 1 ml d’aliquotes dans des tubes sans nucléases.
de précipitation d’ARN1,2 M NaCl, 0,8 M de citrate de sodium dans de l’eau sans nucléases. Préparez-vous à l’avance dans des conditions strictement exemptes de nucléases. Conserver à température ambiante dans des tubes de faucon de 50 ml.
EthanolSigma459844Utiliser avec de l’eau sans nucléase pour préparer de l’éthanol à 80 %, stocker à -20 °C.
1 M sans nucléases Tris Cl, pH 7,5Lonza51237Solution mère
500 mM EDTA sans nucléases, pH 8,0Invitrogen15575-020Solution mère
10x Tampon de biotinylation (BB)100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA dans de l’eau sans nucléases, faire des aliquotes de 1 ml.
Diméthylformamide (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotine-HPDPPierce21341Préparez une solution mère de 1 mg/ml en dissolvant 50 mg de biotine-HPDP dans 50 ml de DMF. Un réchauffement doux améliore la solubilisation. Conserver à 4 ° ; C en aliquotes de 1 ml.
Phase Lock Gel Tubes lourds 2,0 mlEppendorf0032 005.152En option pour l’étape d’extraction du chloroforme.
Membrane zêtaBIORAD162-0153
10x Tampon100 mM NaOH, 10 mM
EDTA Biotine-oligo-5'-biotine, 25 nucléotides, n’importe quelle séquence
Dodécylsulfate de sodiumFisherBPE9738Pour 100 ml de solution mère à 20 %, ajouter 20 g de SDS à 80 ml de PBS pH 7-8 et ajuster le volume à 100 ml. Maintenir toutes les solutions de SDS à pourcentage élevé au-dessus de 20 °C. Chaud les solutions légèrement si le SDS se précipite.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinePierce21333Préparez une solution mère de 1 mg/ml en dissolvant 50 mg d’iodoacétyl-biotine dans 50 ml de DMF. Un réchauffement doux améliore la solubilisation. Conserver à 4 ° ; C en aliquotes de 1 ml. Génère une biotinylation irréversible spécifique aux thiols.
Tampon phosphaté salinGibco10010-015
bloquant Dot blotMélanger 20 ml 20 % SDS avec 20 ml 1 x PBS pH 7-8 et ajouter de l’EDTA à la concentration finale de 1 mM.
Streptavidine-peroxydase de raifort Laboratoires VecteursSA5004Conserver à -20 ° ;C. Mélanger 10 ml 20 % SDS avec 10 ml 1 x PBS. Ajouter 20 &mu ; l Streptavidine-HRP avant utilisation.
Réactif ECLGE HealthcareRNP2109Utiliser en suivant les instructions du fabricant.
Super RX, X-RA Film, 18x24 cmFujifilm47410 19236
&mu ; Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Rangez les perles à 4 ° ;C.
Tween 20SigmaP1379
Tampon100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1 % Tween 20 en H2O.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817Préparer en tant que DTT de 100 mM dans du H2O sans nucléases, toujours préparer frais avant utilisation.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Stocker les colonnes à 4 ° ; C, les composants restants du kit à température ambiante.
Tubes en polypropylène à vis de 1,5 mlSarstedt72.692.005Compatible avec le Diméthylformamide
Tubes en polypropylène à vis de 2,0 mlSarstedt72.694.005Compatible avec le Diméthylformamide Tubes de
15 mlBD Falcon352096Compatible avec le Diméthylformamide Tubes de
50 mlBD Falcon352070Compatible avec le Diméthylformamide
Toutes les solutions/réactifs doivent être conservés à température ambiante, sauf indication contraire.
Equipment
Spectrophotomètre UV/VISThermo ScientificNanoDrop 1000ou équivalent. Utilisez un faible volume (1-2 &mu ; l) pour les mesures de faibles concentrations d’ARN afin d’éviter une perte excessive d’échantillons.
Tubes à centrifuger en polypropylène 15 mlVWR International525-0153Contrairement aux tubes standard de 15 ml, ceux-ci tolèrent jusqu’à 15 000 × ; g
Centrifugeuse à grande vitesseBeckman CoulterAvanti J-25Ou un équipement équivalent capable d’atteindre 13 000× ; g
Rotor à grande vitesseBeckman CoulterJLA-16250Ou équipement équivalent capable d’atteindre 13 000× ; g
Adaptateurs pour tubes de 15 mlLaborgerä ; te Beranek356964Ou un équipement équivalent capable d’atteindre 13 000× ; g
Centrifugeuse de table réfrigéréeEppendorf5430 ROu équivalent.
ThermomixeurEppendorfThermomixeur compactOu équivalent.
Support magnétiqueMiltenyi Biotec130-042-109Un support peut contenir 8 &mu ; Colonnes Mac.
SubventionBain d’eauSUB Aqua 5Ou équivalent.
Échelle ultra-fineA& DGR-202Ou équivalent.
E-Gel iBase Power SystemInvitrogenG6400UKPour gels d’ARN ; ou équivalent.
E-Gel EX 1 % agarose gels préfabriquésInvitrogenG4020-01Pour gels d’ARN ; ou équivalent.
Tampon de liaison Dot blot Tampon de lavage

Références

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

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