Video Microscopy cellules vivantes de la phagocytose des pathogènes fongiques

Résumé

Nous décrivons des méthodes de microscopie vidéo cellules vivantes de Candida albicans par les macrophages. Ces méthodes permettent spécifiques au stade de l'analyse de la migration des macrophages, la reconnaissance, l'engloutissement et de la maturation du phagosome et de révéler de nouveaux aspects de la phagocytose.

Résumé

Jeu phagocytaire des champignons pathogènes et les microorganismes, plus généralement, peut être considéré comme constitué de quatre étapes distinctes: (i) la migration des phagocytes au site où se trouvent des agents pathogènes, (ii) la reconnaissance du pathogène motifs moléculaires associés (PAMP) par modèle récepteurs de reconnaissance (PRR), (iii) l'engloutissement de micro-organismes liés à la membrane cellulaire des phagocytes, et (iv) le traitement des cellules englouti dans les phagosomes maturation et la digestion de la particule ingérée. Des études qui évaluent la phagocytose dans son intégralité sont informatifs ^{1, 2, 3, 4, 5,} mais sont limitées en ce sens qu'elles ne sont normalement pas rompre le processus en migration, l'engloutissement et de la maturation du phagosome, qui peut être affectée différemment. En outre, ces études évaluer l'absorption comme un événement unique, plutôt que comme un processus continu et dynamique. Nous avons récemment mis au point des technologies d'imagerie cellules vivantes, et ont combiné ces derniers avec l'analyse génétique fonctionnelle des deuxcellules pathogènes et hôte de créer une plate-forme interdisciplinaire pour l'analyse de la fonction des cellules immunitaire inné et pathogénie des champignons. Ces études ont révélé de nouveaux aspects de la phagocytose qui ne peuvent être observés en utilisant systématiquement l'analyse temporelle des interactions moléculaires et cellulaires entre les phagocytes humains et des champignons pathogènes et les microorganismes infectieux en général. Par exemple, nous avons commencé à définir les éléments suivants: (a) les composants de la surface cellulaire nécessaire à chaque étape du processus de reconnaissance, l'engloutissement et de destruction des cellules fongiques ^{1, 6, 7, 8,} (b) la façon dont la géométrie de surface influe sur l'efficacité de l'absorption des macrophages et le meurtre de la levure et des cellules des hyphes ^7, et (c) la façon dont l'engloutissement entraîne une modification du cycle cellulaire et le comportement des macrophages ^{9, 10.}

Contrairement aux simples clichés de points de temps, la vidéo-microscopie des cellules vivantes permet une grande variété de cellules hôtes et des agents pathogènes à étudier en tant que continuous séquences plus longues périodes de temps, fournissant des informations spatiales et temporelles sur un large éventail de processus dynamiques, y compris la migration cellulaire, la réplication et le trafic vésiculaire. Ici, nous décrivons en détail la façon de préparer hôte et les cellules fongiques, et de mener des expériences de microscopie vidéo. Ces méthodes peuvent fournir un guide utilisateur pour les études futures avec d'autres phagocytes et les microorganismes.

Protocole

1. C. Croissance albicans et Conditions

1. Préparer des plaques de gélose SC-Ura en ajoutant 6,9 g de base azotée de levure sans acides aminés, 1 ml de NaOH 1 M, 10 ml à 1% (p / v) du sel hémisulfate adénine et 20 g d'agar technique (précédemment décrites en détail dans ^11). Make up le volume à 900 ml d'eau distillée H ₂ O. Autoclave, laisser refroidir la gélose, mais pas assez pour se solidifier, puis ajouter 50 ml stérile 40% de D-glucose et de 50 ml stérile 4% SC-Ura abandon dans des conditions aseptiques. Mélanger, verser dans des boîtes de Pétri et laisser des boîtes de gélose refroidir et se solidifier. Plaques de gélose Boutique à 5 ° C jusqu'à leur utilisation.
2. Série C. albicans sérotype A, souche CAI4 + CIP10 des stocks glycérol conservés à -80 ° C sur gélose SC-Ura.
3. Incuber la plaque à 30 ° C jusqu'à la formation de colonies et la conserver à 5 ° C.
4. Culture d'un seul C. albicans colonie dans 5 ml SC-Ura support (recette comme en 1.1, mais sans gélose technique) et incuber une nuit à 30° C, 200 rpm afin de générer phase stationnaire C. albicans.

2. C Coloration albicans Utilisation isothiocyanate de fluorescéine (FITC)

1. Ajouter 10 ul C. albicans culture d'une nuit à 990 ul de PBS (pH 7,4) et d'effectuer un comptage des cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
2. Pour faciliter la visualisation de C. albicans lors de tests de phagocytose, tache 1 × 10 ⁸ C. albicans en utilisant 1 mg / ml dans 0,05 M FITC tampon carbonate-bicarbonate (pH 9,6) pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité.
3. Pour supprimer FITC non consolidées, se laver C. albicans dans 1 ml de PBS 1 x, centrifugeuse à 3000 xg pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1 x. Répétez 3 fois.
4. Resuspendre le culot à 1 × 10 ⁶ cellules / ul dans 1 x PBS.

3. Préparation de la Ligne J774.1 macrophages de souris de cellules

1. Maintenir J774.1 macrophages dans le tissu de 75 cm ²des flacons de culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau fœtal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine à 37 ° C avec 5% de CO _2. La préparation des macrophages primaires est décrit ailleurs en détail ^{12, 13.}
2. Grattez J774.1 cellules du flacon de culture tissulaire et transférer dans un tube Falcon de 50 ml. Centrifuger à 600 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot cellulaire.
3. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml préchauffé milieu DMEM supplémenté. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque 1 × 10 ⁶ J774.1 macrophages dans 2 ml du milieu DMEM additionné dans une boîte d'imagerie à base de verre de 35 mm. Incuber une nuit à 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Avant d'imagerie, remplacez milieu DMEM supplémenté avec 2 ml de pré-chauffé complété CO _{2-indépendant} moyenne (avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal (SVF), 200 U / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) contenant 1 uM Lysotracker Rouge MDN-99.

4. Live Video cellulaire phagocytose Microscopie Assay

1. Le choix d'un microscope dépend de ce qui est disponible localement, mais la configuration de microscope devra inclure une phase inversée, une chambre environnementale chauffé à 37 ° C et d'excitation / émission des filtres pour les taches choisies (FITC et TRITC).
2. Allumez le chauffe-microscope avant l'expérience et de laisser suffisamment de temps pour la chambre de contrôle de l'environnement se réchauffer à 37 ° C. Le temps nécessaire pour température de la chambre de stabiliser varie en fonction des réglages différents microscope.
3. Allumez le microscope et l'ordinateur et charger le logiciel d'imagerie. Montez l'antenne d'imagerie sur la platine du microscope et la mise au point de trouver les J774.1 macrophages. Optimiser l'apparence des images TRITC et DIC en ajustant le pourcentage de lumière transmise et les temps d'exposition.
4. Retirer le plat d'imagerie et ajouter 3 × 10 ⁶ FITC teinté C. albicans à til plat. Noter le temps que C. albicans est ajouté à la cuvette. Remettez le plat de la scène et d'optimiser l'affichage des images FITC si nécessaire. Mettre en place une liste de points si nécessaire.
5. Commencer lorsque tous les points d'imagerie sont nets et les canaux sont optimisés. Capturez FITC, TRITC images et DIC chaque minute pendant 6 heures.

Résultats

Ici, nous montrons des résultats représentatifs pour C. absorption albicans par une lignée cellulaire de macrophages murins J774.1 pendant 6 heures une cellule vivante expérience vidéo-microscopie. Figure 1 est un représentant des cellules vivantes film vidéo microscopie, montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Vidéo-microscopie des cellules vivantes permet l'internalisation de C. albicans à être visualisées sans avoir besoin de colorer Candida externe. Cependant, au cours de ces expériences, C. albicans a été coloré avec le colorant sensible au pH FITC (vert), qui est désactivé au cours de l'acidification du phagosome des macrophages, et facilite la confirmation que Candida a été internalisé (figure 1). Pour visualiser l'aide supplémentaire de ingéré C. albicans, les macrophages ont été colorées en utilisant la fluorescence rouge Lysotracker colorant rouge MDN-99, quels compartiments taches acides et sert de marqueur non spécifique de la maturation du phagosome.La figure 2 est une image fixe à partir d'une expérience de cellules vivantes vidéo microscopie et illustre la variation du nombre de C. albicans ingérés par les macrophages J774.1 individuels. Dans cette expérience, 82% des macrophages J774.1 englouti au moins un C. albicans cellule à la fin de l'essai 6 h phagocytose. Dans la figure 3, le nombre de intériorisée C. cellules albicans par des macrophages est signalée. Le nombre moyen de C. albicans repris par des macrophages est de 3,4, mais il est intéressant macrophages peuvent ingérer jusqu'à 16 cellules fongiques. Figure 4 est une séquence d'images fixes à partir d'un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage phagocytant C. cellules albicans, la croissance hyphe avec le macrophage et la lyse des macrophages en fin de compte. Figure 4 illustre le fait que la vidéo-microscopie permet l'analyse des événements qui ont suivi l'embrasement de cellules cibles, à savoir les données peuvent être générés pour le kiLLING des macrophages par C. albicans hyphes en ce qui concerne le nombre et la morphogenèse des cellules cibles ingérés, et le meurtre des macrophages se rapporte à la façon dont la maturation du phagosome qui peuvent être étudiés en temps réel.

Figure 1. Cellules vivantes film microscopie vidéo montrant la phagocytose de C. albicans par murins J774.1 macrophages. Les macrophages sont colorées par le rouge fluorescent Lysotracker colorant rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Les macrophages et C. albicans ont été co-cultivées pendant une période de 6 heures à 37 ° C dans le CO _2-complet indépendant milieu. Les images ont été capturées à des intervalles de 1 min pour 6 heures. Les macrophages peuvent être vus établir contact cellule-cellule avec C. albicans, qui est ensuite suivie par l'absorption de C. albicans dans les phagosomes des macrophages. Les flèches indiquent C. albicans avant l'engloutissement par J774.1 macrophages. Cette vidéo montre également que la fluorescence FITC est QuEnched engloutissement suivante de C. albicans. La barre d'échelle, 10 pm. Cliquez ici pour voir le film .

Figure 2. Variation microscopie vidéo représentative de cellule vivante image fixe représentant le nombre de C.albicans englouties par les macrophages individuels. Macrophages (teinté à l'aide Lysotracker rouge MDN-99) ont été co-cultivées avec FITC teinté C. albicans (vert). Il ya des variations dans le nombre de C. albicans englouti (un nombre à côté d'une flèche indique le nombre de C. albicans englouti), et C. morphologie albicans (levure soit versets hyphes). La barre d'échelle, 20 um.

Figure 3. Graphique montrant le nombre de C. albicans ingérée par J774.1 macrophage murin à la fin de 6 tests de phagocytose h. Les données représentent les 2 expériences indépendantes. Un total de 100 macrophages ont été comptés à partir de 3 champs de chaque expérience, ce qui donne un total de 600 macrophages individuels.

Figure 4. Une série d'images à partir d'un représentant des cellules vivantes expérience microscopie vidéo montrant un macrophage (M) et C. albicans (C) avant et pendant la reconnaissance (A, B), et pendant et après l'absorption (C, D). C. albicans hyphes continuer à croître dans le macrophage (E, F), ce qui peut entraîner la lyse des macrophages (G). D'autres macrophages sont recrutés au site de rupture et de tentative d'ingérer le libéré C. albicans (H). Les macrophages sont colorées par le rouge colorant fluorescent LysoTracker rouge MDN-99, et C. albicans sont colorées par FITC (vert). Noter que la coloration FITC est éteint après C. absorption albicans par J774.1 macrophages (C). La barre d'échelle, 10 pm.

Discussion

Voici la méthode pour l'utilisation de la vidéo-microscopie des cellules vivantes pour étudier la phagocytose des macrophages est décrite. Vidéomicroscopie offre de multiples couches d'informations supplémentaires pour l'analyse. Un avantage essentiel est que les données d'absorption peut être générée (à partir d'une seule expérience) pour tout point dans le temps tout au long de la période de 6 heures d'observation. Plus important encore, la méthode décrite permet une analyse différentielle des différentes étapes de la phagocytose. Nous avons, par exemple, montré que les changements dans l'absorption globale de C. glycosylation albicans et des mutants de la morphogenèse par des lignées cellulaires de macrophages et les macrophages primaires peut être une conséquence de l'évolution de la migration des macrophages vers les cellules cibles ou le taux d'immersion fois contact cellule-cellule est établi ^7.

Il ya un certain nombre d'écueils à éviter lors de la conduite de ces expériences. Tout d'abord, il est très important de s'assurer des conditions environnementales stables tout au long de la procédure expérimentaleDure. Le meilleur moyen est dans une chambre climatique qui est réglé pour les conditions expérimentales plusieurs heures avant de commencer l'expérience. La qualité vidéo est très dépendante des modules sophistiqués qui utilisent des lasers infrarouges pour maintenir automatiquement l'échantillon position z, indépendamment des changements mécaniques ou thermiques, éliminant ainsi la nécessité pour les corrections mise au point manuelle.

Compte tenu de la nature étendue de ces expériences, il est important de limiter l'exposition de lumière laser et effets associés photoblanchiment et photoconversion, qui peut être minimisé en utilisant des marqueurs fluorescents hautement, ce qui facilite les temps d'exposition faible. Le protocole de coloration FITC décrit ici est rapide et fiable. Comme FITC est un très lumineuses et stable tache, temps d'exposition faibles sont nécessaires, ce qui le rend idéal pour les longues FITC time-lapse films. Cependant, nous avons l'habitude d'utiliser une variété de taches cibles différentes, y compris calcofluor blanc et colorants PKH ainsi que les organismes marqués.

La plupart de notre travail publié est réalisé en utilisant un microscope à champ large, mais l'exposition peut être diminuée en utilisant un microscope confocal à disque rotatif et dans nos mains ce qui est essentiel pour la microscopie time-lapse vidéo 3D.

Au cours de cette étude, les images ont été capturées à des intervalles de 1 min sur un essai de phagocytose 6 heures. L'intervalle entre les images peut être ajustée en fonction du procédé objet de l'enquête. Par exemple, l'intervalle peut être diminué lorsque l'étude des processus rapides tels que le trafic vésiculaire. L'intervalle de temps minimum sera limitée par les spécifications du microscope et de la caméra. Il ya quelques considérations à prendre en compte lors de l'ajustement des synchronisations. Tout d'abord, diminuer l'intervalle entre les clichés se traduira par moins de points peuvent être visualisés et la taille du fichier sera considérablement augmentée. Au contraire, l'augmentation de l'intervalle image trop se faire le film perd la continuité.

Cette approche peut être appliquéeen principe, d'étudier d'autres agents pathogènes et l'absorption de la mort des cellules hôtes. Par exemple, nous avons récemment montré que les macrophages de la moelle osseuse provenant de souris déficientes en sialoadhésine présentent grandement réduit la liaison et la phagocytose des sialylé Campylobacter jejuni ^8. Cependant, la taille de la cible est un déterminant important de la faisabilité, comme l'analyse d'images devient de plus en plus difficile avec une réduction de la taille de la cellule cible. Un logiciel sophistiqué d'analyse d'image est essentielle pour l'analyse vidéo microscopie rapide, ce qui devrait aller de pair avec un soutien approprié bioinformatique pour faciliter la génération d'algorithmes pour étudier la migration des cellules individuelles et des populations de cellules entières ^7. Vidéo-microscopie des cellules vivantes en combinaison avec le logiciel d'analyse d'image sophistiqué pour l'analyse minute par minute de la migration des macrophages et individuels-C.albicans interactions, offre une perspective unique sur la complexité de C. phagocytose albicans par macrophages. Il ya un énorme potentiel pour élargir ces méthodes pour étudier d'autres agents pathogènes et les phagocytes (cellules dendritiques, les neutrophiles) et de développer la vidéo-microscopie 3D pour l'imagerie interactions cellule-cellule avec plus de détails ou sur des surfaces plus physiologiques tels que des couches de cellules épithéliales et endothéliales. Cette technique fait partie de la prochaine génération d'outils pour l'étude des interactions hôte-pathogène et permettra de générer des informations détaillées spatiale et temporelle sur un large éventail de processus dynamiques.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Base azotée de levure sans acides aminés	Formedium	CYN0402
NaOH	Sigma	S5881-500G
Sel hémisulfate adénine	Sigma	A3159-25G
Agar technique (n ° 3)	Oxoid	LP0013
D-glucose	Sigma	G7021-1KG
SC-Ura abandon	Formedium	DSCK102
FITC	Sigma	F7250-1G
Carbonate de sodium	BDH	301215M
Le bicarbonate de sodium	BDH	102475W
PBS	Gibco	18912-014
DMEM	Lonza	BE12-614F
FCS	Life Technologies	10106169
Pénicilline / streptomycine	AAP	P11-010
L-glutamine	Lonza	BE17-605E
Lysotracker Rouge MDN-99	Invitrogen	L7528
35 mm de verre plats	AAP	PAA12305160X