Cet article décrit la préparation de tissus mélanome fraîchement obtenu dans des cultures de cellules primaires, et comment supprimer les contaminations des érythrocytes et des fibroblastes à partir des cellules tumorales. Enfin, nous décrivons comment CD133 + Putatifs cellules souches de mélanome sont triés du CD133 - En vrac en utilisant magnétique tri cellulaire activé (MACS).
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Article de méthode
Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133
Dans cet article
Résumé
Résumé
Malgré l'existence de traitements améliorés pour les mélanomes disponibles aujourd'hui, les patients atteints de mélanome malin avancé encore un mauvais pronostic pour la survie sans progression et globale. Par conséquent, la recherche translationnelle doit fournir une preuve supplémentaire moléculaire pour améliorer les thérapies ciblées pour les mélanomes malins. Dans le passé, les mécanismes oncogéniques liés au mélanome ont été largement étudiées dans des lignées cellulaires établies. Sur le chemin de traitements plus personnalisés basés sur les profils génétiques, nous proposons d'utiliser des lignées cellulaires dérivées de patients au lieu de lignées cellulaires génériques. Avec les données cliniques de haute qualité, en particulier sur le suivi des patients, ces cellules seront déterminants afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine la progression du mélanome.
Ici, nous présentons la mise en place des cultures de mélanomes primaires de tissu tumoral frais disséqués. Cette procédure comprend le hachage et la dissociation du tissu dans des cellules individuelles, reDépose des contaminations avec des érythrocytes et des fibroblastes ainsi que la culture primaire et de vérification fiable de l'origine des cellules de mélanome.
De récents rapports ont révélé que les mélanomes, comme la plupart des tumeurs, le port d'une petite sous-population de cellules souches cancéreuses (CSC), qui semblent exclusivement alimenter l'initiation et la progression tumorale vers le stade métastatique. L'un des principaux marqueurs pour l'identification et l'isolement du SCC dans le mélanome est CD133. Pour isoler CD133 + CSC à partir de cultures primaires de mélanome, nous avons modifié et optimisé le tri cellulaire magnétique actif (MACS) procédure de Miltenyi résultant de la pureté de tri haute et la viabilité de CD133 + et CD133 CSC - en vrac, ce qui peut être cultivée et fonctionnellement analysé par la suite.
Introduction
Mélanomes malins cutanés sont le type le moins fréquent, encore plus mortelle de cancer de la peau. En raison d'une incidence croissante, un haut grade de malignité et d'une diffusion rapide, les mélanomes comptent maintenant pour 75% des tumeurs malignes de la peau liées 1,2 décès. En plus de l'exérèse chirurgicale de la tumeur primitive, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie et combiné chimio-immunothérapie du mélanome et des métastases sont les stratégies state-of-the-art pour le traitement du mélanome 3,4. Toutefois, le mélanome malin est caractérisée par une faible réponse aux agents chimiothérapeutiques (5-12%) 5,6....
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Protocole
Le schéma global de l'expérience, y compris la préparation des primaires simples cellules du tissu tumoral, la caractérisation de la culture cellulaire primaire, l'épuisement des fibroblastes et le tri magnétique de cellules CD133 + et du CD133 - cellules de mélanome est illustré à la figure 1.
1. Acquisition d'échantillon
- Vérifiez l'approbation éthique avant d'envisager les prochaines étapes.
- Préparer un tube de 50 ml avec du PBS stérile additionné de 1% de pénicilline-streptomycine concentration finale et le remettra à la chirurgie ou l'équipe.
- ....
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Résultats
Préparation de mono-cellules provenant de tissu tumoral
La figure 2 illustre une métastase ganglionnaire résection d'un patient atteint de mélanome stade avancé avant (A) et après (B) dissociation mécanique en 2-4 morceaux mm. Après dissociation enzymatique du tissu et filtration à travers un maillage de 70 um nylon, cellules ont été sédimentées et le surnageant est rejeté. À cette étape, nous avons observé une forte contamination par les globules rouges, comme indiqué par .......
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Discussion
Afin d'éliminer les contaminations érythrocytaires de la cellule tumorale pellets nous recommandons fortement d'utiliser la solution de lyse des globules rouges à partir de Miltenyi. Les avantages de la lyse des érythrocytes au cours de la centrifugation sur gradient de Ficoll densité traditionnelle est qu'il est plus rapide et plus simple. De plus, les contaminations par Ficoll ou de globules rouges et de la perte des cellules tumorales sont évités. Lorsque vous observez la croissance des fibroblastes dans .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Remerciements
Les auteurs remercient le Professeur M. Dietel et Dirk Schumacher pour soutenir ce travail et la lecture critique du manuscrit.
Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du soutien de l'entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 115234, les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et les entreprises EFPIA »dans contribution en nature. Ce travail a également été soutenue par le Krebsgesellschaft Berliner (BKG).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactif | |||
| Accutase | Laboratoires AAP GmbH | L11-007 | |
| L'amphotéricine B solution de 250 pg / ml dans de l'eau désionisée | Sigma-Aldrich, Inc | A2942-50ml | |
| anti-fibroblastes microbilles | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133 / 1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagénase IV | Sigma-Aldrich, Inc | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS sans Ca, Mg | Laboratoires AAP GmbH | H15-002 | |
| Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc | E-7889 | |
| FBS supérieure | Biochrom | S0615 | |
| Indirecte CD133 humain Kit Micro-Bead | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Comprend: CD133 / 1 (AC133)-biotine, anti-Biotine microbilles et le réactif de blocage FcR |
| Pénicilline-streptomycine, liquide (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | Laboratoires AAP GmbH | U15-815 | |
| Red solution de lyse des globules (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Équipement | |||
| Cell crépine (70 um) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociateur | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| Support multi séparateur MACS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| Colonnes séparation MACS 25 colonnes LS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| Rotator Tube MACSmix | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Avant sa cessation filtres | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| Séparateur QuadroMACS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Filtres pour seringues Rotilabo (0,22 um, PSE) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP filtre Unité 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
Références
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G.
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Réimpressions et autorisations
