Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l'ARN et de l'ADN dans les échantillons biomoléculaires

Résumé

Une suite de tests colorimétriques est décrit pour la protéine rapidement distinctif, d'ARN, d'ADN, et re-duire des sucres dans des échantillons biomoléculaires potentiellement hétérogènes.

Résumé

L'expérimentation biochimique nécessite généralement une connaissance précise, à un stade précoce, de l'acide nucléique, des protéines et des composants biomoléculaires autres spécimens potentiellement hétérogènes. Les acides nucléiques peuvent être détectés par plusieurs approches établies, y compris les méthodes d'analyse qui sont spectrophotométrique (par exemple, A _260), fluorimétrique (par exemple, la fixation de colorants fluorescents), ou colorimétriques (nucléosidiques spécifiques à des réactions chimiques chromogènes) ^1. Bien qu'il ne puisse distinguer facilement ARN à partir de l'ADN, l'A ₂₆₀ / A ratio de ₂₈₀ est couramment utilisé, car il offre un moyen simple et rapide ² évaluation de la teneur relative de l'acide nucléique, qui absorbe principalement près de 260 nm et de protéines, qui absorbe principalement près de 280 nm. Ratios <0,8 sont pris comme une indication de «pures» des échantillons de protéines, tandis que pur acide nucléique (NA) est caractérisé par des ratios> 1,5 ^3.

However, il existe des scénarios dans lesquels la teneur en protéines / NA peut ne pas être aussi clairement ou de manière fiable déduite de simples uv-vis des mesures spectrophotométriques. Par exemple, (i) des échantillons peut contenir une ou plusieurs protéines qui sont relativement dépourvu des acides aminés aromatiques responsables de l'absorption à 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), comme c'est le cas avec certaines petites protéines de liaison d'ARN, et (ii) Les échantillons peuvent présenter des intermédiaires A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapports (~ 0,8 <~ 1.5), où la teneur en protéines / NA est beaucoup moins clair et peut même refléter une certaine affinité élevée association entre la protéine et les composants NA. Pour ces scénarios, nous décrivons ici une suite de tests colorimétriques de distinguer rapidement l'ARN, l'ADN et les sucres réducteurs dans un échantillon potentiellement mixte de biomolécules. Les méthodes reposent sur la sensibilité différentielle des pentoses et d'autres glucides à Benoît, Bial (orcinol), et de DISCHE (diphénylamine) réactifs, les protocoles simplifiés peuvent être comachevé en quelques minutes, sans aucune étape supplémentaire d'avoir à isoler les composants. Les analyses peuvent être effectuées en parallèle à la différence entre l'ARN et l'ADN, ainsi que d'indiquer la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, le ribose et (Figure 1).

Introduction

Une grande partie de la biologie cellulaire se produit via des interactions moléculaires impliquant l'ADN et de l'ARN. ⁴ Ces acides nucléiques d'origine naturelle (AN) interagissent les uns avec les autres, ^{5 pour} les protéines, les ⁶ et avec une multitude de composés à petites molécules et des ligands in vivo (par exemple, les cations divalents ^7). Les interactions peuvent être de courte ou de longue durée (cinétique), peut aller de modéré à élevé pour une faible affinité (force thermodynamique), et peuvent également présenter des variations importantes dans les propriétés chimiques e....

Protocole

1. Benoît Dosage de sucres réducteurs

1. Préparer une quantité appropriée de solution de Benedict - 940 mM de carbonate de sodium anhydre, 588 mM de citrate de sodium dihydraté, 68 mM de sulfate de cuivre pentahydraté (II). Ce réactif peut être conservé à température ambiante (TA) pendant au moins six mois, sans changement notable dans la réactivité.
2. Le réactif ci-dessus est 6x. Ainsi, pour 600 réactions ul, ajouter 100 ul de réactif de Benedict propre à un tube de 1,5 ml (par exemple Eppendorf marque), par échantillon à doser.
3. Ajouter allant de 10 ul à 500 ul d'échantillon de ce tube, le volume optimal peut être déterminé sur....

Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 3 pour l'application de ces tests colorimétriques à des composés de référence connus. Représentatifs des données qualitatives sont présentées pour la Benedict (a), orcinol Bial (b), et DISCHE de diphénylamine (c) les essais et les courbes standard pour ces trois essais sont présentés dans la figure 4. Dans les panneaux 3 (ac), les panneaux de gauche montrent les expériences de contrôle positifs / négatifs en utilisant des analytes convenab.......

Discussion

Les essais colorimétriques présentés ici offrent une approche simple pour évaluer rapidement la nature chimique des mélanges biomoléculaires, tels que ceux rencontrés lors de la purification des protéines, ARN ou des complexes de l'ensemble du lysat cellulaire en préparation pour des études ultérieures. En biologie structurale poursuit assemblages plus locuteur natif, les défis progressivement plus grandes, telles que l'hétérogénéité des échantillons, seront posées par les complexes complexes et multi-comp.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif ou de l'équipement	Fournisseur / entreprise	Numéro de catalogue	Les commentaires, les notes
Carbonate de sodium anhydre	Fisher Scientific	S263
Citrate de sodium dihydraté	Sigma	S-4641
Pentahydrate de sulfate de cuivre (II)	VWR	VW3312-2
Monohydrate Orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentré	VWR	BDH3030
Chlorure ferrique hexahydraté	Sigma	F-2877
Diphénylamine	Aldrich	112763
L'acide acétique glacial	Fisher Scientific	A28
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	258105
L'éthanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	préparation à 1% p / v dans H 2 O
L'acide ribonucléique de la levure de boulangerie (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep à 10 mg / ml de H 2 O; conserver à -20 ° C
L'acide désoxyribonucléique (sel de sodium), à partir de thymus de veau	Sigma	D1501	prep à 10 mg / ml de H 2 O; conserver à 4 ° C
			Réactifs, équipement et sécurité Les matériaux sont listé dans la following table dans l'ordre dans lequel ils apparaissent dans la section Protocole. Sauf indication contraire (ci-dessus), tous les réactifs peuvent être conservés à température ambiante et l'éclairage. Pour les éléments qui ne figurent pas ci-dessous (par exemple, des microtubes), la marque habituelle / modèle / série dans un laboratoire standard biochimique peut être utilisée (par exemple, Eppendorf de 1,5 ml de la marque microtubes). Standard microtubes en plastique doit être utilisé pour les mesures impliquant centrifugation (par exemple, à la matière particulaire des sédiments près de la fin de chaque protocole). Aucun matériel particulier est préférable, aussi longtemps que les tubes peuvent être scellés, les tubes en polypropylène typiques trouvés dans les laboratoires de biochimie fonctionnent bien. Pour ce qui est des questions de sécurité et d'élimination des déchets, les précautions standard de laboratoire (lunettes de sécurité, des hottes) devrait être exercée en pré-office, travailler avec, et l'élimination des solutions contenant acétique concentré, l'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique. Pour les réactifs organiques tels que orcinol ou diphtérieénylamine, des gants en nitrile sont préférables au latex commune (caoutchouc naturel) variété.