Rapid tests colorimétriques de vue qualitatif Distinguer l'ARN et de l'ADN dans les échantillons biomoléculaires

Résumé

Une suite de tests colorimétriques est décrit pour la protéine rapidement distinctif, d'ARN, d'ADN, et re-duire des sucres dans des échantillons biomoléculaires potentiellement hétérogènes.

Résumé

L'expérimentation biochimique nécessite généralement une connaissance précise, à un stade précoce, de l'acide nucléique, des protéines et des composants biomoléculaires autres spécimens potentiellement hétérogènes. Les acides nucléiques peuvent être détectés par plusieurs approches établies, y compris les méthodes d'analyse qui sont spectrophotométrique (par exemple, A _260), fluorimétrique (par exemple, la fixation de colorants fluorescents), ou colorimétriques (nucléosidiques spécifiques à des réactions chimiques chromogènes) ^1. Bien qu'il ne puisse distinguer facilement ARN à partir de l'ADN, l'A ₂₆₀ / A ratio de ₂₈₀ est couramment utilisé, car il offre un moyen simple et rapide ² évaluation de la teneur relative de l'acide nucléique, qui absorbe principalement près de 260 nm et de protéines, qui absorbe principalement près de 280 nm. Ratios <0,8 sont pris comme une indication de «pures» des échantillons de protéines, tandis que pur acide nucléique (NA) est caractérisé par des ratios> 1,5 ^3.

However, il existe des scénarios dans lesquels la teneur en protéines / NA peut ne pas être aussi clairement ou de manière fiable déduite de simples uv-vis des mesures spectrophotométriques. Par exemple, (i) des échantillons peut contenir une ou plusieurs protéines qui sont relativement dépourvu des acides aminés aromatiques responsables de l'absorption à 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), comme c'est le cas avec certaines petites protéines de liaison d'ARN, et (ii) Les échantillons peuvent présenter des intermédiaires A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapports (~ 0,8 <~ 1.5), où la teneur en protéines / NA est beaucoup moins clair et peut même refléter une certaine affinité élevée association entre la protéine et les composants NA. Pour ces scénarios, nous décrivons ici une suite de tests colorimétriques de distinguer rapidement l'ARN, l'ADN et les sucres réducteurs dans un échantillon potentiellement mixte de biomolécules. Les méthodes reposent sur la sensibilité différentielle des pentoses et d'autres glucides à Benoît, Bial (orcinol), et de DISCHE (diphénylamine) réactifs, les protocoles simplifiés peuvent être comachevé en quelques minutes, sans aucune étape supplémentaire d'avoir à isoler les composants. Les analyses peuvent être effectuées en parallèle à la différence entre l'ARN et l'ADN, ainsi que d'indiquer la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, le ribose et (Figure 1).

Introduction

Une grande partie de la biologie cellulaire se produit via des interactions moléculaires impliquant l'ADN et de l'ARN. ⁴ Ces acides nucléiques d'origine naturelle (AN) interagissent les uns avec les autres, ^{5 pour} les protéines, les ⁶ et avec une multitude de composés à petites molécules et des ligands in vivo (par exemple, les cations divalents ^7). Les interactions peuvent être de courte ou de longue durée (cinétique), peut aller de modéré à élevé pour une faible affinité (force thermodynamique), et peuvent également présenter des variations importantes dans les propriétés chimiques et la spécificité - certaines associations sont très spécifiques (par exemple, l'ADN · · · facteurs de transcription, l'ARN · · · facteurs d'épissage), tandis que d'autres interactions sont nécessairement beaucoup plus générique (par exemple, l'ADN · · · bactériennes comme les protéines histone-HU ^8). Interactions non spécifiques avec AN peut avoir des conséquences pratiques pour les expériences in vitro impliquant des mélanges de biomolecules, comme il est possible, et même probable, que certains AN va associer avec les biomolécules d'intérêt, du moins dans un sous-ensemble des conditions expérimentales utilisées (force ionique, le pH, etc.)

Considérons, par exemple, la production d'une protéine d'intérêt (POI) par l'intermédiaire hétérologue sur-expression de la protéine recombinante dans la culture d'Escherichia coli cellule, une telle procédure est réalisée en routine dans pratiquement n'importe quel laboratoire de biologie structurale ⁹ En préparation pour d'autres expériences, comme. que la caractérisation biochimique / biophysique, cristallisation, etc., les premiers efforts se concentrent généralement sur ​​l'obtention d'une quantité suffisante de POI en tant que pure que possible, idéalement dans un échantillon chimiquement homogène et biophysique monodisperse. Après la perturbation des cellules hôtes, les premières étapes d'un flux de travail typique de purification visent à isoler le POI de E. coli protéines, des acides nucléiques, des débris de parois cellulaires,et d'autres composants du lysat cellulaire. Cependant, l'hôte AN peut co-purifient avec le POI pour plusieurs raisons physico-chimiques - un POI fortement basique peut non spécifiquement déroulant hôte d'ADN / ARN, le POI peut avoir un générique NA activité de liaison (par exemple, le susmentionné HU); le POI peut être une assez spécifique NA-binding protein, mais présentent une réactivité croisée avec des ARN ou ADN hôte; hôte AN peut interagir avec une matrice de chromatographie et de ce fait tout simplement co-éluer avec le POI, et ainsi de suite. Sans discrimination, de haute affinité de liaison de l'hôte AN vers un POI peut poser un problème épineux car les impuretés NA sera vraisemblablement d'entraver des expériences en aval (par exemple, les dosages d'anisotropie de fluorescence de POI contraignant • ARN ^10). Alternativement, POI imprévue · · · associations NA peut également être vu par hasard, que ces interactions éclairer nucléique du POI acide capacité de liaison. De toute façon, si AN sont des éléments clés ou de contaminants, il faut d'abord quantifier etidentifier le type (ADN, ARN) de co-purification AN en préparation pour les expériences en aval.

Plusieurs méthodes analytiques existent pour détecter et quantifier dans un échantillon AN. La plupart des méthodes disponibles sont fondamentalement soit spectrophotométrique (par exemple, A ₂₆₀ et des valeurs d'absorbance A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapports), fluorimétrique (par exemple, la liaison de thiazole orange ou d'autres colorants fluorescents à NA), ou colorimétriques (sensibilité de nucléosides à des réactions chimiques que chromophores absorbant rendement dans la région UV-VIS du spectre électromagnétique), comme l'a récemment décrit par De Mey et al. ¹ Toutefois, l'étape cruciale de l'identification du type de polynucléotide tel que l'ARN ou de l'ADN est au-delà de la portée d'un grand nombre de ces quantification approches. Ici, nous fournissons un ensemble de tests colorimétriques pour identifier rapidement les types de composants NA dans un échantillon protéique.

Les protocoles décrits ici cun être efficacement exécutée sans mesures supplémentaires d'isoler les impuretés potentielles NA, et reposent sur ​​le dosage de Benoît XVI pour les sucres réducteurs ^11, pour le dosage orcinol pentoses ^{12,13, 14,15} et réactions diphénylamine de 2'-deoxypentoses (figures 1 et 2) . Test de la Bénédict (figure 2a) utilise la capacité de la forme linéaire, à chaîne ouverte (aldéhyde) d'un sucre aldose à réduire Cu ^{2 +,} avec oxydation simultanée de carbonyle du sucre à un groupement carboxylate et production de Cu ₂ O en tant que insoluble précipité rouge. Cette réaction avec un résultat positif libres des sucres réducteurs, tels que les aldoses et les cétoses (qui convertissent les aldoses correspondants via les intermédiaires endiol), mais pas avec les sucres pentoses qui sont verrouillés en forme cyclique comme partie du squelette covalent de l'ADN ou un polynucléotide d'ARN. En raison de l'exigence minimaliste d'une fonctionnalité gratuite hémiacétal, autre compounds qui pourrait le test est positif dans cet essai - et donc agir comme interférents potentiels - notamment α-hydroxy-cétones et d'oligosaccharides de courte durée (par exemple, le maltose disaccharide). À la fois l'd'Bial orcinol (figure 2b) et Dische de diphénylamine (figure 2c) réactions sont basés sur la destruction initiale du squelette polynucléotidique, par l'intermédiaire d'une dépurination de l'nucléoside et d'acide ou encore catalysée par une base d'hydrolyse des nucléotides parent, pour donner furan-2 -carbaldéhyde (furfural) dérivés; ces dérivés réagissent ensuite avec soit un phénol polyhydroxylé tels que orcinol (Bial) ou diphénylamine (Dische l') les réactifs pour former des produits de condensation de couleur de la structure chimique largement inconnus. L'ADN par rapport à la spécificité de l'ARN du dosage Dische provient du fait que le sucre pentose doit être 2'-désoxygéné afin d'être sensible à l'oxydation à ω-aldéhyde hydroxylevulinyl, qui réagit en outre avec la diphénylaminedans des conditions acides pour obtenir un bleu vif condensat (figure 2c). En utilisant les protocoles simplifiés décrits ici, nous avons constaté que ces réactions colorimétriques spécifiques à sucre peut différencier entre l'ARN et de l'ADN, et indiquent également la présence de sucres réducteurs libres tels que le glucose, le fructose, ribose ou dans un échantillon biomoléculaire.

Protocole

1. Benoît Dosage de sucres réducteurs

1. Préparer une quantité appropriée de solution de Benedict - 940 mM de carbonate de sodium anhydre, 588 mM de citrate de sodium dihydraté, 68 mM de sulfate de cuivre pentahydraté (II). Ce réactif peut être conservé à température ambiante (TA) pendant au moins six mois, sans changement notable dans la réactivité.
2. Le réactif ci-dessus est 6x. Ainsi, pour 600 réactions ul, ajouter 100 ul de réactif de Benedict propre à un tube de 1,5 ml (par exemple Eppendorf marque), par échantillon à doser.
3. Ajouter allant de 10 ul à 500 ul d'échantillon de ce tube, le volume optimal peut être déterminé sur la base de l'intensité de la formation de couleur dans un essai de fonctionnement initial. Si l'échantillon est suffisante avant de commencer ces essais au volume d'échantillon maximale possible (soit cinq sixièmes de la réaction globale du volume, 500 ul de l'échantillon dans le cas présent), puis diluer dans des essais ultérieurs.
4. Ajouter ddH ₂ O à la TUêtre de ramener le volume final à 600 ul; mélanger la solution au vortex ou pipetage.
5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
6. Retirer l'échantillon chauffé du bain et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 min.
7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre.
9. Blank le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau.
10. Mesurer l'absorbance de l'échantillon à 475 nm.

2. Essai Orcinol Bial pour les sucres pentoses

1. Préparer une quantité appropriée de réactif de Bial frais de - 24,2 mM orcinol monohydraté (voir Figure 2b de la structure de ce composé), 6 M HCl, 0,025% p / v chlorure ferrique hexahydraté. Remarque:Pour un stockage prolongé, le réactif de Bial peuvent être préparés comme deux solutions de stock distinctes: (i) Réactif A [0,05% p / v FeCl3 • 6H ₂ O dans HCl concentré] et (ii) Réactif B [422 mM monohydrate orcinol préparé dans 95 % d'éthanol]. Réactif A peut être conservé à température ambiante pendant six mois; Réactif B peut être conservé à 4 ° C pendant un mois, recouverts d'une feuille de limiter l'exposition de la lumière. Ces solutions mères sont mélangés dans un 15 (A): 1 (B) v / v rapport avant utilisation.
2. Le réactif ci-dessus est 2x. Ainsi, pour les réactions de 1,0 ml, ajouter 500 ul de réactif de Bial propre à un tube de 1,5 ml par échantillon à doser.
3. Ajouter allant de 10 à 500 ul ul d'échantillon à ce tube. Conformément à la note 1.3 (ci-dessus), si l'échantillon est suffisante avant de commencer réactions essais avec le volume d'échantillon maximale possible (c.-à-moitié le volume de réaction globale, 500 ul d'échantillon dans le cas présent) et diluer à partir de là.
4. Ajouter ddH ₂ O dans le tube pour amener le fle volume inal à 1,0 ml, mélanger la solution au vortex ou pipetage.
5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
6. Retirer l'échantillon chauffé du bain et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 10 min.
7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre pour une inspection visuelle.
9. Pour analyse semi-quantitative, vide le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau et de mesurer l'absorbance de la cuve d'échantillon à 660 nm.

3. Dische de dosage Diphénylamine pour 2'-deoxypentose Sucres

1. Préparer une quantité appropriée de réactif Dische de diphénylamine - 60 mM diphénylamine, 11 M d'acide acétique glacial, 179 mM d'acide sulfurique, 62% v / v d'éthanol. Ce réactif peut être prépar rapport à l'avance et stocké à température ambiante dans un endroit sombre, ou recouverts d'une feuille, pour limiter l'exposition de la lumière. En raison de la sensibilité à la lumière réactif ne doit pas être stockées indéfiniment, mais en pratique, il peut être préparé tous les deux à trois mois sans changement apparent de la réactivité.
2. Le réactif ci-dessus est 2x. Ainsi, pour les réactions de 1,0 ml, ajouter 500 ul de réactif Dische à un endroit propre tube de 1,5 ml par échantillon à doser.
3. Ajouter allant de 10 à 500 ul ul d'échantillon à ce tube. Conformément à la note 1.3 (ci-dessus), si l'échantillon est suffisante avant de commencer réactions essais avec le volume d'échantillon maximale possible (c.-à-moitié le volume de réaction globale, 500 ul d'échantillon dans le cas présent) et diluer à partir de là.
4. Ajouter ddH ₂ O sur le tube pour amener le volume final de 1,0 ml, mélanger la solution au vortex ou pipetage.
5. Incuber les échantillons pendant 20 min dans un bain d'eau bouillante.
6. Retirer l'échantillon chauffé de la salle de bain et alloil w refroidir à température ambiante pendant 10 min.
7. Centrifuger le tube échantillon à> 9300 xg (~ 10.000 rpm dans un FA45-24-11-Eppendorf fixe l'angle du rotor) pendant 5 min afin de sédimenter toute matière particulaire; cette étape est plus importante pour les études quantitatives plutôt que qualitatives.
8. Aliquote du surnageant à partir de ce tube dans une cuve propre pour une inspection visuelle.
9. Pour analyse semi-quantitative, vide le spectrophotomètre UV-VIS avec de l'eau et de mesurer l'absorbance de la cuve d'échantillon à 600 nm.

4. Remarques sur l'utilisation d'autres

1. Les catégories suivantes de molécules sont des composés de référence appropriés pour des réactions témoins positifs et négatifs pour chaque essai:
   • Benoît XVI - Positif = sans ribose, le fructose, le glucose, négatif = ARN, ADN, ATP, etc. (Tout saccharide manque une fonctionnalité sans sucre réducteur)
   • Bial - Positif = ARN (extrait de levure de boulanger par exemple), le ribose, l'ATP, l'UMP, négatif = bovin serviceeuh albumine (BSA) ou toute autre protéine
   • Dische de - Positif = ADN (par exemple thymus de veau); négative = ARN, ATP, etc. (N'importe quel nucléotide non-2'-désoxygéné)
2. Ces essais ont été jugés plutôt bien résisté à des composés souvent utilisés dans la purification des protéines; par exemple, les sels communs tels que NaCl, (NH _{4) 2} SO ₄ et K ₂ SO ₄ n'a pas interféré, et les réactions apparaissent généralement pas affecté par le contenu du diluant. Détergents ou des agents chaotropes tels que l'urée peut affecter la réactivité des tests si le pH est fortement basique, un pH neutre à acide est généralement la plus optimale pour les années Bial et analyses DISCHE à cause de la chimie de la réaction sous-jacente (voir le texte et les protons la figure 2b, c). Conditions de la réaction potentiellement interférents sous-optimales, suspects, etc. devrait être testé sur une base au cas par cas, en utilisant positifs et négatifs des expériences de contrôle wcomposés de référence vec.

Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 3 pour l'application de ces tests colorimétriques à des composés de référence connus. Représentatifs des données qualitatives sont présentées pour la Benedict (a), orcinol Bial (b), et DISCHE de diphénylamine (c) les essais et les courbes standard pour ces trois essais sont présentés dans la figure 4. Dans les panneaux 3 (ac), les panneaux de gauche montrent les expériences de contrôle positifs / négatifs en utilisant des analytes convenab...

Discussion

Les essais colorimétriques présentés ici offrent une approche simple pour évaluer rapidement la nature chimique des mélanges biomoléculaires, tels que ceux rencontrés lors de la purification des protéines, ARN ou des complexes de l'ensemble du lysat cellulaire en préparation pour des études ultérieures. En biologie structurale poursuit assemblages plus locuteur natif, les défis progressivement plus grandes, telles que l'hétérogénéité des échantillons, seront posées par les complexes complexes et multi-comp...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif ou de l'équipement	Fournisseur / entreprise	Numéro de catalogue	Les commentaires, les notes
Carbonate de sodium anhydre	Fisher Scientific	S263
Citrate de sodium dihydraté	Sigma	S-4641
Pentahydrate de sulfate de cuivre (II)	VWR	VW3312-2
Monohydrate Orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentré	VWR	BDH3030
Chlorure ferrique hexahydraté	Sigma	F-2877
Diphénylamine	Aldrich	112763
L'acide acétique glacial	Fisher Scientific	A28
Acide sulfurique	Sigma-Aldrich	258105
L'éthanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	préparation à 1% p / v dans H 2 O
L'acide ribonucléique de la levure de boulangerie (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep à 10 mg / ml de H 2 O; conserver à -20 ° C
L'acide désoxyribonucléique (sel de sodium), à partir de thymus de veau	Sigma	D1501	prep à 10 mg / ml de H 2 O; conserver à 4 ° C
			Réactifs, équipement et sécurité Les matériaux sont listé dans la following table dans l'ordre dans lequel ils apparaissent dans la section Protocole. Sauf indication contraire (ci-dessus), tous les réactifs peuvent être conservés à température ambiante et l'éclairage. Pour les éléments qui ne figurent pas ci-dessous (par exemple, des microtubes), la marque habituelle / modèle / série dans un laboratoire standard biochimique peut être utilisée (par exemple, Eppendorf de 1,5 ml de la marque microtubes). Standard microtubes en plastique doit être utilisé pour les mesures impliquant centrifugation (par exemple, à la matière particulaire des sédiments près de la fin de chaque protocole). Aucun matériel particulier est préférable, aussi longtemps que les tubes peuvent être scellés, les tubes en polypropylène typiques trouvés dans les laboratoires de biochimie fonctionnent bien. Pour ce qui est des questions de sécurité et d'élimination des déchets, les précautions standard de laboratoire (lunettes de sécurité, des hottes) devrait être exercée en pré-office, travailler avec, et l'élimination des solutions contenant acétique concentré, l'acide chlorhydrique ou d'acide sulfurique. Pour les réactifs organiques tels que orcinol ou diphtérieénylamine, des gants en nitrile sont préférables au latex commune (caoutchouc naturel) variété.