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Article de méthode

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

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⸱

DOI :

10.3791/50242

⸱

14 mars 2013

 ,  , 
1Proteomics and Metabolomics Facility, Colorado State University

Dans cet article

Résumé

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. Cet article décrit un flux de travail typique utilisé pour le profilage non ciblé des métabolites du sérum, y compris l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, l’analyse des données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites.

Résumé

Le profilage des métabolites non ciblés par chromatographie liquide ultra performante couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS) est une technique puissante pour étudier le métabolisme. L’approche offre une analyse impartiale et approfondie qui peut permettre le développement de tests de diagnostic, de nouvelles thérapies et d’approfondir notre compréhension des processus pathologiques. La diversité chimique inhérente au métabolome crée d’importants défis analytiques et il n’existe pas d’approche expérimentale unique capable de détecter tous les métabolites. De plus, la variation biologique du métabolisme individuel et la dépendance du métabolisme vis-à-vis des facteurs environnementaux nécessitent un grand nombre d’échantillons pour atteindre la puissance statistique appropriée requise pour une interprétation biologique significative. Pour relever ces défis, ce tutoriel décrit un flux de travail analytique pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. La procédure comprend des lignes directrices pour l’organisation et la préparation des échantillons, l’acquisition de données, le contrôle de la qualité et l’identification des métabolites et permettra une acquisition fiable de données pour de grandes expériences et fournira un point de départ pour les laboratoires novices en matière de profilage non ciblé des métabolites par UPLC-MS.

Introduction

Le terme « métabolomique » peut englober beaucoup de choses. Par exemple, une expérience métabolomique peut être réalisée à l’aide de diverses plateformes analytiques telles que la RMN et la chromatographie en phase gazeuse et/ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. De plus, les expériences métabolomiques peuvent être réalisées de manière ciblée ou non ciblée, ou une combinaison des deux. Une expérience métabolomique ciblée impliquera l’analyse dirigée d’un panel de molécules importantes pour la question biologique à l’étude (par exemple, de petites molécules impliquées dans le cycle du TCA permettront une quantification précise de cette voie). Dans cette situation, l’hypothèse biologique dicte le choix des métabolites à cibler dans l’analyse et les étapes analytiques sont optimisées pour la détection de ces molécules. Alternativement, une expérience métabolomique non ciblée génère des hypothèses. Dans ce cas, l’expérience est réalisée de manière large et impartiale pour permettre la détection d’autant de métabolites que possible. Les résultats d’une expérience non ciblée orienteront l’étape suivante de la recherche (qui, dans de nombreux cas, peut impliquer un flux de travail métabolomique ciblé). Il est également possible de combiner les deux approches, auquel cas une expérience est réalisée de manière non ciblée pendant qu’un panel de molécules connues est suivi dans les données.

Le tutoriel présenté ici se concentre spécifiquement sur le profilage non ciblé des métabolites du sérum. Comme décrit ci-dessus, l’approche non ciblée fournit une vue impartiale des métabolites détectables, peut générer de grandes quantités d’information et, en fin de compte, permettre de nouvelles découvertes. L’utilisation de cette approche, qui utilise spécifiquement la chromatographie liquide à ultra performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS), se généralise 1, 2, 3 et implique les étapes suivantes : (1) conception expérimentale (2) prélèvement d’échantillons (3) préparation de l’échantillon (4) acquisition de données par UPLC-MS (5) prétraitement des données (détection de pics, intégration, alignement et normalisation) (6) analyse statistique de données (uni- et multivariées) (7) identification de métabolites et (8) biologique interprétation.

Actuellement, il n’existe pas de méthodes standard établies pour le profilage des métabolites non ciblés basé sur UPLC-MS et les étapes ultérieures de prétraitement des données. Ce manque de normalisation est dû en partie à l’un des principaux défis analytiques du profilage des métabolites ; la diversité chimique du métabolome. En raison de cette diversité, il est impossible pour une seule méthode d’extraction ou d’acquisition par spectrométrie de masse de fournir une couverture complète de tous les métabolites en une seule analyse. En théorie, la couverture des métabolites peut être maximisée en utilisant plusieurs extractions (par exemple, aqueuse, méthanol, chloroforme :méthanol, etc.) couplées à diverses conditions chromatographiques (par exemple, phase inverse, HILIC, etc.) et à divers modes d’ionisation (par exemple, ion positif, ion négatif, ionisation chimique, etc.). Souvent, cependant, les chercheurs n’ont pas de biais prédéterminé pour une classe chimique spécifique et les dépenses liées à la réalisation de plusieurs extractions et acquisitions d’instruments ne sont donc pas justifiées, en particulier pour les expériences à grande échelle. Ainsi, le tutoriel vidéo présenté ici a été conçu pour fournir une procédure générale pour le profilage non ciblé des métabolites sériques à grande échelle par UPLC-MS. Il permettra aux laboratoires nouveaux et établis d’effectuer ces types d’expériences et les éléments de base sur lesquels ils peuvent étendre l’approche à divers types d’échantillons, à des classes chimiques spécifiques ou à des analyses ciblées. Plus précisément, ce protocole comprendra les étapes suivantes : préparation des échantillons de sérum, organisation des échantillons pour les études à grande échelle, acquisition de données UPLC-MS, procédures de contrôle de la qualité (CQ) et identification des métabolites. Des stratégies de prétraitement des données et d’analyse statistique sont également présentées.

Le protocole ne se concentrera pas sur les étapes de conception expérimentale, de collecte d’échantillons ou d’interprétation des données biologiques, car il est en dehors du cadre de ce tutoriel. Cependant, de nombreuses ressources existent dans la littérature sur ces sujets et les auteurs encouragent les chercheurs novices en métabolomique à les explorer en profondeur 4, 5, 6, 7, 8, 9. En particulier, la conception expérimentale est extrêmement importante et essentielle au succès d’une expérience métabolomique non ciblée. Des facteurs tels que la réplication biologique appropriée et l’uniformité de la procédure de prélèvement des échantillons (p. ex. temps passé sur la paillasse, température d’entreposage, temps d’entreposage, congélation-décongélation, etc.) doivent être pris en compte pour assurer la viabilité de l’étude et faciliter l’interprétation biologique appropriée des données.

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Protocole

1. Exemple d’organisation

  1. Pour créer une carte de plaque pour la préparation d’échantillons sur une feuille de calcul, entrez dans la première colonne une liste d’échantillons par ordre de chargement. Dans une deuxième colonne, entrez les 96 emplacements des plaques de puits en utilisant la nomenclature correcte pour votre logiciel d’échantillonneur automatique.
  2. Conservez un puits dans chaque plaque pour les échantillons de contrôle qualité.
  3. Si votre passeur d’échantillons LC peut traiter deux plaques à la fois, séparez la liste d’échantillons en lots de 190 et enregistrez ces informations dans une deuxième feuille de travail.
  4. Dans chacun de ces lots, utilisez la fonction randomize [note : « =rand()"dans Excel] pour randomiser l’ordre d’injection. Copiez et collez maintenant votre ordre d’injection dans le système logiciel de file d’attente d’échantillons LC-MS. La randomisation doit se produire entre les lots, à l’intérieur des lots, et être unique entre les répétitions d’injection.

2. Procédures de préparation des échantillons de sérum et de contrôle de la qualité (CQ)

  1. Préparez un stock de 10 ml d’échantillon de CQ contenant au moins quatre composés de masse et de temps de rétention connus qui couvrent l’élution chromatographique de l’expérience. (Remarque : caféine, réserpine, sulfadiméthoxine et terfénadine à une concentration de 2 μg/ml chacune).
  2. Décongelez les échantillons de sérum sur de la glace et agitez doucement pendant ~5 secondes.
  3. Pré-mouillez les pointes d’une pipette à 12 canaux avec du méthanol pour éviter l’égouttement des pointes lors de la distribution de l’échantillon. Ajoutez ensuite 370 μl de méthanol froid dans chaque puits d’une plaque à 96 puits.
  4. Transférez 100 μl de chaque échantillon à l’emplacement de plaque correspondant à partir des cartes de plaques. Couvrir les plaques et laisser incuber à -80 °C pendant 30 min pour précipiter les protéines.
  5. Faites tourner les plaques dans une centrifugeuse à 4 °C à 3 200 x g pendant 30 min. Transférez 250 μl de surnageant dans un nouveau surnageant à 96 puits et répétez la centrifugation.
  6. Transférez maintenant 60 μl d’aliquotes du surnageant sur trois plaques de 96 puits adaptées à l’échantillonneur automatique UPLC ou LC.
  7. Ajouter 100 μl de mélange d’échantillon de CQ à la position de puits réservée sur la plaque.
  8. Scellez chaque plaque avec un film adhésif. Le solvant peut s’évaporer rapidement après le perçage du puits, et les injections ne doivent donc être effectuées qu’une seule fois à partir de chaque plaque. Les plaques dans la file d’attente d’échantillons peuvent être stockées à court terme à -20 °C.

3. Acquisition de données UPLC-MS

  1. Réglez l’échantillonneur automatique à 4 °C et placez les deux premières plaques dans l’échantillonneur automatique.
  2. Configurez la méthode d’acquisition à l’aide de l’un des deux gradients de phase inverse alternatifs. Le gradient A est biaisé en faveur des molécules non polaires tandis que le gradient B fournira une meilleure couverture des molécules modérément polaires.
    1. Pente A :
      Temps (min)%A%Bcourbe
      0,01000 
      0,110006
      1.060406
      3,030706
      11,001006
      17,001006
      17.110006
      23,010006
    2. Dégradé B
      Temps (min)%A%Bcourbe
      0,01000 
      110006
      135956
      165956
      16.0510006
      2010006
  3. Réglez le spectromètre de masse pour collecter des données en mode positif à partir de 50-1 200 m/z. Des conditions spécifiques supplémentaires à l’instrument varieront en fonction du système utilisé. Ce qui suit représente les conditions d’utilisation sur notre spectromètre de masse Waters Xevo G2 Q-TOF : Énergie de collision = 6V ; Temps de balayage = 0,2 s par balayage ; Tension capillaire = 2 200 V ; Température de la source = 150 °C Température de désolvatation = 350 °C Débit de gaz de désolvatation (N2) = 800 L/h).
  4. Injectez les échantillons de contrôle qualité cinq fois au début de chaque lot de 2 plaques d’échantillons. Après avoir conditionné le système UPLC-MS avec les deux premières injections, surveillez la surface du pic (<25 % RSD), le temps de rétention (+/- 0,05 min) et la précision de masse (+/- 3 ppm) de la troisième à la cinquième injection. Il peut être nécessaire d’ajuster ces paramètres pour s’adapter aux spécifications de l’instrument utilisé pour l’acquisition de données.
  5. Si les échantillons de CQ réussissent, acquérez des données sur les échantillons de sérum pour ces deux plaques. En cas d’échec des échantillons de contrôle qualité, les données d’échantillon ne sont pas collectées tant que le problème n’est pas résolu et que les échantillons de contrôle qualité ne réussissent pas. Dans notre laboratoire, nous avons constaté que ces paramètres sont constamment stables sur trois jours d’injections (c’est-à-dire l’injection de 2 plaques de 96 puits). Si votre système s’avère instable pendant cette période, des injections de contrôle qualité plus fréquentes peuvent être appropriées. L’échantillon de CQ n’est pas utilisé pour corriger des données de mauvaise qualité, mais pour empêcher la collecte de données de mauvaise qualité.

4. Détection, intégration, alignement et normalisation des pics

Il existe une variété d’options pour effectuer ces étapes, y compris des logiciels gratuits et des outils spécifiques au fournisseur. Cette étape a été sautée dans le tutoriel vidéo, mais notre approche est décrite ci-dessous à titre d’exemple.

Pour chaque échantillon, les données analytiques générées par ce type d’expérience sont un profil d’ions décrit par un temps de rétention, une valeur m/z et une intensité spectrale. Une expérience de profilage de métabolites non ciblée sera composée de nombreux échantillons et, par conséquent, la détection des pics, l’alignement du temps de rétention et la normalisation doivent être effectués pour permettre une analyse statistique ultérieure de l’ensemble de données.

  1. Exportez les données brutes au format .cdf à l’aide du logiciel Waters DataBridge. Effectuez la détection des pics et l’alignement du temps de rétention à l’aide du progiciel XCMS 10 (logiciel gratuit disponible à l'http://metlin.scripps.edu/xcms/) et est exécuté dans l’environnement statistique R11). Le site Web contient de la documentation sur la façon de télécharger et d’exécuter le logiciel.
  2. Utilisez la méthode du « filtre adapté » dans XCMS avec les paramètres suivants : pleine largeur à mi-hauteur = 8 sec, rapport S/B = 3, maximum de 100 pics pour chaque chromatogramme ionique extrait. Effectuez les étapes de regroupement de fonctionnalités, de correction du temps de rétention, de regroupement et de fillPeaks. Le résultat du logiciel XCMS est une matrice de données avec toutes les caractéristiques détectables répertoriées sous forme de lignes, chaque échantillon expérimental sous forme de colonne, et les cellules sont remplies avec la surface du pic de chaque caractéristique dans chaque échantillon. La transposition de cet ensemble de données peut être nécessaire pour l’intégration dans les flux de travail statistiques en aval.
  3. Normalisez la matrice de données dans R en divisant l’aire de pic de chaque caractéristique d’un échantillon donné par la somme de l’aire de pic ionique extrait (appelée courant ionique total, ou TIC pour cet échantillon (multipliée par 100 000 pour rendre les nombres plus propices à l’interprétation visuelle des données).
  4. Éliminez les valeurs aberrantes. Les valeurs aberrantes dans les données peuvent résulter soit d’une mauvaise injection d’un bon échantillon, soit d’une bonne injection d’un mauvais échantillon.
    1. Effectuez la détection des valeurs aberrantes dans R à l’aide du package de valeurs aberrantes avec les paramètres suivants : (1) valeurs TIC et (2) scores PC avec un niveau de confiance de 99,9 %.
    2. Si des valeurs aberrantes sont présentes, les fichiers de données correspondants sont supprimés et les procédures de détection des pics, d’alignement et de normalisation sont à nouveau exécutées.
  5. Faites la moyenne des aires de pics normalisées par identificateur d’échantillon (pour faire la moyenne des injections multiples). Cela doit être fait avant d’effectuer une analyse statistique (notez que les répétitions d’injection tiennent compte de la variation analytique, mais ne peuvent pas être utilisées comme de véritables réplicats biologiques).

5. Analyse statistique

Pour les expériences métabolomiques, des techniques statistiques multivariées et univariées sont nécessaires pour l’interprétation des données. Deux techniques couramment utilisées sont l’analyse en composantes principales et l’analyse de variance (ANOVA). Il existe de multiples façons d’aborder l’analyse statistique des données, et des outils logiciels open source et commerciaux sont disponibles. Cette étape a été sautée dans le tutoriel vidéo, mais notre approche est décrite ci-dessous à titre d’exemple.

  1. Effectuez une ANOVA en appliquant une fonction aov à l’ensemble de données dans R.
  2. Tenez compte des faux positifs à l’aide d’un ajustement de Benjamini-Hochberg (fonction p.adjust dans R).
  3. Réalisez l’ACP avec l’ensemble de données à l’échelle de Pareto (la variance unitaire peut également être appliquée) et centré sur la moyenne. Les scores PC et les chargements sont calculés à l’aide du package pcaMethods dans R.
  4. Utilisez les valeurs p de l’ANOVA, les scores de charge et les paramètres de changement de pli pour déterminer les caractéristiques moléculaires qui décrivent le mieux la variation associée au traitement expérimental.
  5. Interrogez manuellement chaque caractéristique moléculaire d’intérêt pour déterminer si elle correspond à un ion moléculaire, à un adduit (par exemple, sodium, potassium ou dimère) ou à une perte neutre.

6. Identification des métabolites

Le flux de travail présenté ici est très général et peut être appliqué aux résultats de n’importe quelle plate-forme d’instrument. Une stratégie alternative est présentée dans la section Discussion.

  1. Pour toutes les caractéristiques statistiquement significatives (telles que déterminées à partir de l’analyse à l’étape 6), examinez les données brutes et confirmez que les ions parents, les adduits sodiques, les isotopes et les fragments suivent des tendances similaires dans l’ensemble de données. Par exemple, la valeur p dérivée de l’ANOVA pour un ion parent doit être similaire à son isotope. Cela indique que les deux caractéristiques moléculaires correspondent au même métabolite.
  2. Recherchez des mesures de masse précises et/ou des pertes neutres de caractéristiques moléculaires statistiquement significatives (choisissez l’isotope C12 si plusieurs isotopes sont significatifs) dans des bases de données internes (si disponibles) ou accessibles au public, telles que :
    1. Base de données sur le métabolome humain (http://www.hmdb.ca/)
    2. Metlin (http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php)
    3. Banque de masse (http://www.massbank.jp/?lang=en)
    4. Cartes lipidiques (http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html)
    5. National Institute of Standards and Technology MS Search (http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/)
  3. Utilisez un logiciel pour prédire une formule moléculaire à partir de la distribution précise de la masse et des isotopies de vos caractéristiques moléculaires significatives. Dans le logiciel Waters, cela s’effectue à l’aide de l’outil Elemental Comp dans le package MassLynx.
  4. Filtrez l’identification des métabolites candidats en fonction de l’erreur de masse (adaptée à votre plate-forme d’instrument), de la formule moléculaire prédite, de la pertinence biologique dans les tendances observées par rapport à la conception expérimentale et du temps de rétention (par exemple, les lipides et autres composés non polaires auront des temps de rétention plus longs lors de l’utilisation de la chromatographie en phase inverse).
  5. Effectuer des expériences ultérieures pour acquérir la fragmentation MS/MS pour des caractéristiques moléculaires statistiquement significatives. Dans la mesure du possible, l’identification des métabolites devrait être basée sur l’appariement des pics de fragmentation expérimentaux et du temps de rétention à ceux d’un étalon authentique acquis sur le même instrument. Alternativement, la fragmentation expérimentale peut être appariée à une base de données spectrale.
  6. Le niveau de confiance dans l’identification devrait être attribué à toutes les identifications de métabolites signalées sur la base des recommandations12.
    de l’initiative des normes métabolomiques. Niveau 1 : identification moléculaire fiable basée sur des paramètres analytiques orthogonaux (masse précise, temps de rétention et fragmentation MS/MS) par rapport à un composé authentique.
    Le niveau 2 fait référence à une identification présumée basée sur des propriétés physicochimiques et/ou une similitude spectrale avec la littérature ou les bibliothèques spectrales.
    Le niveau 3 fait référence à l’identification présumée d’une classe de composés sur la base de propriétés physicochimiques ou de similitude spectrale.
    Le niveau 4 fait référence à un composé inconnu.

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Résultats

Les étapes analytiques de base d'une expérience de profilage métabolomique non ciblé par UPLC-MS sont décrites dans la Figure 1. Les données brutes de chaque échantillon peuvent être visualisées sous forme de chromatogramme de pics de base. La Figure 2 présente un exemple de chromatogramme de pics de base d'un échantillon de sérum analysé selon l'option de gradient (a) du didacticiel. Après l'analyse statistique décrite ci-dessus, une identification des métabolites est tentée pour toutes...

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Discussion

Ce tutoriel est destiné à servir de point de départ pour la réalisation d’un profilage de métabolites non ciblé à grande échelle par UPLC-MS. Le flux de travail se concentre sur les métabolites qui peuvent être extraits avec un solvant aqueux de méthanol, retenus sur une colonne UPLC C8 ou C18 et détectés sous forme d’ions positifs. Dans le cas où il n’y a pas de biais prédéterminé en faveur d’une classe de métabolites spécifique et qu’une hypothèse générant un profil global est souhaitée, ce protocole est précieux car i...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Le tutoriel présenté a été réalisé et développé au sein de l’installation de protéomique et de métabolomique de l’Université d’État du Colorado, qui est partiellement financée par les ressources d’administration de la recherche CSU pour les projets universitaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
96 plaques de puits - 500 &mu ; l puits VWR40002-020Ceux-ci sont utilisés pour la préparation d’échantillons
96 tapis de plaquesde puits VWR89026-514 Ceux-cisont utilisés pour la préparation d’échantillons
96 plaques de puits - 350 &mu ; l puits WatersCorporationWAT058943Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons
96 tapis de plaques de puitsWaters Corporation186000857Ceux-ci sont utilisés pour l’injection d’échantillons
96 scellages thermiques de plaques de puitsWaters Corporation186002789Ceux-ci peuvent être utilisés pour l’injection d’échantillons ou le stockage à long terme
96 scelleuse thermique de plaques de puits Waters Corporation186002786
Méthanol de qualité LC-MSFluka34966
Acétonitrile de qualité LC-MSFluka34967
formique de qualité LC-MSFluka56302
Pipette électronique multicanauxVWR89000-674
Pointes PipettEclipse (achetée via Light Labs)B-5061/B-4061
Centrifugeuse réfrigérée - Allegra X-12RBeckman CoulterN/A - contact Beckman Coulter
Acquity Ultra performance Chromatographie liquide (UPLC) SystemWaters CorporationN/A - contact Waters Corporation
UPLC C8 colonne (option de dégradé a)Waters Corporation186002876
Colonne UplC T3 (option de gradient b) Waters Corporation186003536
Xevo G2 Q-TOFSpectromètre de masse Waters CorporationN/A - contacter Waters Corporation
Acide

Références

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