ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Résumé

Haut-débit sélectif 2 'acylation hydroxyle analysés par extension d'amorce (SHAPE) utilise une nouvelle chimique sonder la technologie, la transcription inverse, l'électrophorèse capillaire et les logiciels de prédiction de structure secondaire pour déterminer les structures des ARN de plusieurs centaines à plusieurs milliers de nucléotides à une résolution au nucléotide.

Résumé

Comprendre la fonction de l'ARN impliqués dans les processus biologiques requiert une connaissance approfondie de la structure de l'ARN. À cette fin, la méthodologie baptisée «haut débit 2 sélectif 'acylation hydroxyle analysés par extension d'amorce» ou la forme, permet de prédire la structure secondaire de l'ARN avec une résolution au nucléotide. Cette approche utilise des agents chimiques de sondage qui ACYLATE préférentiellement régions câblé ou flexible simples d'ARN en solution aqueuse. Sites de modification chimique sont détectés par transcription inverse de l'ARN modifié, et les produits de cette réaction sont fractionnés par électrophorèse capillaire automatisé (CE). Depuis la transcriptase inverse s'arrête à ces nucléotides d'ARN modifiées par les réactifs de forme, la banque d'ADNc résultant mappe indirectement ces ribonucléotides qui sont simple brin dans le contexte de l'ARN repliées. Utiliser un logiciel de ShapeFinder, les électrophérogrammes produites par automatisé CE sont traités et transformés en nutables de réactivité cleotide qui sont eux-mêmes transformés en contraintes pseudo-énergie utilisée dans le RNAStructure (v5.3) de l'algorithme de prédiction. Les structures d'ARN à deux dimensions obtenues par combinaison d'une forme de sondage avec in silico ARN prédiction de structure secondaire ont été trouvés à être beaucoup plus précis que les structures obtenues en utilisant soit la méthode utilisée seule.

Introduction

Pour comprendre les fonctions des ARN catalytiques et non-codantes impliquées dans la régulation de l'épissage, la traduction, la réplication du virus et le cancer, une connaissance détaillée de la structure d'ARN est nécessaire ^1,2. Malheureusement, la prédiction exacte du repliement des ARN constitue un formidable défi. Agents de sondage classiques souffrent de nombreux inconvénients tels que la toxicité, la couverture de nucléotides incomplètes et / ou le débit limité à 100-150 nucléotides par expérience. Secondaires algorithmes de prédiction de structure spontanées sont tout aussi désavantageux, en raison d'inexactitudes résultant de leur i....

Protocole

conception d'amorce et l'extension du terminal de l'ARN 3 '

Pour analyser les longs ARN par le SHAPE à haut débit, une série de sites d'hybridation des amorces doit être choisi de telle sorte qu'ils (i) sont séparés par environ 300 nt, (ii) sont 20-30 nt en longueur, et (iii) que l'ARN / hybrides d'ADN produites par un recuit d'ADN à ces sites ont une température de fusion prévue de> 50 ° C. En outre, des segments d'ARN qui sont prévus pour être très structurées doivent être évités, mais prend une telle décision nécessite une certaine connaissance préalable de la structure de l'ARN, ce qui est souv....

Résultats

ARN contenant le VIH-1 élément rev de réponse (RRE), et une extrémité 3 'de la cassette de la structure ⁴ est préparé à partir d'un plasmide linéarisé par la transcription in vitro, après quoi elle a été plié par chauffage, de refroidissement, et l'incubation à 37 ° C en présence de MgCl _2. L'ARN a été exposé à NMIA puis une transcription inverse à partir d'une amorce d'ADN 5'-fin-marquée hybridée à la borne cassette de structure de l'extrémité 3 &#.......

Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour la forme à haut débit, une technique qui permet de déterminer la structure secondaire de la résolution d'un nucléotide simple pour des ARN de toute taille. En outre, le couplage des données du SHAPE expérimentales avec secondaires algorithmes de prédiction de structure facilite la génération de modèles 2D ARN avec un degré de précision plus élevé que ce qui est possible avec soit seule méthode. La combinaison d'amorces marquées par fluorescence et automatisé CE four.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
N-methylisatoid anhydride (NMIA)	Life technologies	M25	Dissous dans
l’anhydride anhydre DMSO 1-methyl-t-nitroisatoic (1M7)	voir réf. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10 000 unités
de séquençage du cycle Thermo sequenase	Affymetrix	78500
Matériaux fournis par l’utilisateurfort
d’intérêt			6 pmol par réaction (la limite de détection sera déterminée par l’instrument)
Ensembles de quatre amorces marquées 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 et WellRed D1/Licor IR800)			Les amorces sont complémentaires à l’ARN et sont utilisées dans les réactions de transcription inverse et de séquençage. Les fluorophores énumérés sont optimaux pour le Beckman Coulter 8000 CEQ. Les amorces peuvent être achetées ou synthétisées en interne.
L’ADN			est utilisé pour le séquençage des réactions et doit contenir la séquence de l’ARN étudié, y compris toute extension 3'terminale, le cas échéant. Le cas échéant, il est souvent pratique d’utiliser le modèle de transcription de l’ARN.
Buffers
10x Tampon			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X Tampon			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Ce tampon peut être modifié selon le cas (par exemple pH, EDTA, Mg, inhibiteur de la RNase)
2.5X RT mix			4 &mu ; l 5X tampon, 1 &mu ; l 100 mM TNT, 1.5 &mu ; l eau,1 &mu ; l 10 mM dNTPs, 0,5 &mu ; l SuperScript III. Notez que le tampon 5X et la TNT 100 mM sont fournis avec l’achat de SuperScript III (Invitrogen).
Solution de chargement d’échantillons GenomeLab (Beckman Coulter)			Attention : Évitez plusieurs cycles
EQUIPMENT
Électrophorèse capillaire	Beckman	CEQ8000
Thermocycleur	varie

Kit de renaturation d’ARN de repliement d’ARN de gel-dégel