Séparation de souris embryonnaires ectoderme visage et Mesenchyme

Résumé

Un protocole pour la séparation de l'ectoderme embryonnaire visage et le mésenchyme est décrite. Nous utilisons dispase II pour traiter les embryons entiers d'abord, disséquer l'ensemble du visage protubérances sur, puis séparer l'ectoderme facial et le mésenchyme.

Résumé

Fentes orofaciales sont les défauts les plus fréquents cranio-faciales, qui touchent 1,5 en 1000 ^1,2 nouveau-nés dans le monde entier. Clefting orofaciale est causée par ³ un développement anormal du visage. Chez l'homme et la souris, la croissance initiale et structuration de la face repose sur plusieurs petits bourgeons de tissu pour le visage, les proéminences ^4,5. Le visage est dérivée à partir de six protubérances frontales principales paires: les processus nasaux (FNP), les protubérances maxillaires (MXP) et des proéminences mandibulaires (MdP). Ces protubérances sont constitués de gonflements de mésenchyme qui sont enfermés dans un épithélium sus-jacent. Etudes de multiples espèces ont montré que la signalisation diaphonie entre ectoderme et le mésenchyme facial est essentiel pour façonner la face ^6. Pourtant, les détails mécanistiques concernant les gènes impliqués dans ces relais de signalisation font défaut. Une façon d'acquérir une compréhension globale de l'expression des gènes, facteur de transcription liant, et les marques associées à la chromatine le déveectoderme ping visage et le mésenchyme est d'isoler et de caractériser les différents types de tissus séparés.

Nous présentons ici une méthode pour séparer l'ectoderme facial et mésenchyme au jour embryonnaire (E) 10,5, une étape critique du développement de la formation de la souris pour le visage qui précède la fusion des protubérances. Notre méthode est une adaptation de l'approche que nous avons utilisée précédemment pour disséquer les protubérances du visage ^7. Dans cette étude, plus tôt nous avions utilisé C57BL consanguine / 6 souris que cette souche est devenu un standard pour la génétique, la morphologie du visage et de la génomique ^8. Ici, cependant, en raison des quantités plus limitées de tissus disponibles, nous avons utilisé le consanguine souche CD-1 qui est moins cher à l'achat, plus robuste pour l'élevage, et qui tend à produire plus d'embryons (12-18) par portée que n'importe quel consanguine souche de souris ^8. Suite à l'isolation embryon, neutre protéase dispase II a été utilisé pour traiter l'embryon entier. Ensuite, les protubérances faciales ont été disséquered dehors, et l'ectoderme facial a été séparé du mésenchyme. Cette méthode permet de conserver à la fois l'ectoderme facial et le mésenchyme intacte. Les échantillons obtenus selon cette méthode ne peut être utilisé pour des techniques telles que la détection de protéines, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) analyse, études de puces à ADN et l'ARN-seq.

Protocole

1. Préparer dispase II

1. Préparer une nouvelle solution saline tamponnée Hepes (EBM) (50 mM de HEPES / KOH à pH 7,4, NaCl 150 mM). Ajouter 2 ml 0,5 M HEPES / KOH pH 7,4 et 1,2 ml 2,5 M de NaCl dans 16,8 ml ultrapure H O. ₂
2. Faire 10 mg / ml dispase II. Peser 0,2 g dispase II (Roche, Cat # 4942078001) et dissoudre dans 20 ml de HBS. Préparer des aliquotes de 1,0 ml dans des tubes Eppendorf individuelles et conserver à -20 ° C pour stockage à long terme.
3. Diluer 10 mg / ml dispase II 1:10 dans PBS avant de les utiliser. Mettez le diluée dispase II sur la glace.

2. Disséquer CD-1 embryons E10.5 Femme....

Résultats

Après dispase II le traitement, l'ectoderme de l'embryon tend à être lâche. Les protubérances du visage doivent être intacts après dissection (figure 2A). L'ectoderme isolé du visage est clair et exempt de tissu mésenchyme (figure 2B). Pour déterminer l'efficacité du protocole et de détecter toute contamination croisée, nous dosés pour prosencéphale exprimé ZIC3 ^9, ectodermique spécifique CDH1 ⁵ et mésenchymateuses spécifique SOX10 ^{10 à l'a.......}

Discussion

Ce protocole fournit une méthode simple pour séparer l'ectoderme embryonnaire de la souris pour le visage et le mésenchyme basée sur une première étape de traitement dispase II. Dans des études antérieures, nous avons procédé à la dissection des protubérances du visage avant dispase II du traitement, mais nous avons toujours trouvé que le mésenchyme devient "collante" et plus difficile à manipuler. Notre nouveau protocole permet d'éviter ce problème. Combinaison dispase II le traitement avec la force p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dispase II (protéase neutre, grade II)	Roche	4942078001	Préparer 10 mg/ml de solution mère de Dispase II dans HBS. Aliquote et stockage à -20 ° ; C .
ARNALATER	Ambion	AM7021