La migration des cellules dendritiques de surveillance utilisant l'imagerie par résonance 19F / 1H magnétique

Résumé

Suivi des cellules en utilisant l'IRM a attiré l'attention remarquable dans les dernières années. Ce protocole décrit le marquage des cellules dendritiques avec le fluor ( ¹⁹ Particules F)-riches, l'application in vivo de ces cellules, et la surveillance de l'étendue de leur migration vers le ganglion drainant avec ¹⁹ F / ¹ H IRM et ¹⁹ F MRS.

Résumé

Progrès continus en matière modalités d'imagerie non invasives comme l'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont grandement amélioré notre capacité à étudier les processus physiologiques ou pathologiques dans les organismes vivants. IRM s'avère également être un outil précieux pour la capture des cellules transplantées in vivo. Les premières stratégies de marquage cellulaire pour utilisation d'agents de contraste IRM qui influencent les temps de relaxation MR (T1, T2, T2 *) et conduire à une amélioration (T1) ou l'épuisement (T2 *) du signal où les cellules marquées sont présentes. T2 agents d'amélioration * tels que les agents ultrapetites d'oxyde de fer (USPIO) ont été utilisés pour étudier la migration cellulaire et certains ont également été approuvé par la FDA pour une application clinique. Un inconvénient de T2 * agents est la difficulté de distinguer l'extinction du signal créé par les cellules marquées d'autres artefacts tels que des caillots de sang, des saignements ou des micro-bulles d'air. Dans cet article, nous décrivons une nouvelle technique pour le suivi in vivo des cellules quisont basées sur le marquage des cellules avec du fluor ⁽¹⁹ F)-particules riches. Ces particules sont préparées par émulsification d'hydrocarbures perfluorés (PFC) et de composés ensuite utilisé pour marquer les cellules, qui peuvent ensuite être visualisées par ¹⁹ F IRM. Les avantages importants de PFC pour le suivi des cellules in vivo comprennent (i) l'absence de carbone lié à ¹⁹ F in vivo, ce qui donne alors des images sans fond et complète de cellules selectivityand (ii) la possibilité de quantifier le signal de la cellule de ¹⁹ F spectroscopie MR .

Introduction

Le suivi des cellules in vivo est un aspect crucial dans plusieurs domaines de la biomédecine. Pour cela, les techniques d’imagerie non invasives qui peuvent localiser sélectivement les cellules sur une période de temps sont extrêmement précieuses. Avant le développement de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) tridimensionnelle, le suivi de la migration des cellules immunitaires se limitait à des analyses microscopiques ou à des biopsies tissulaires. Le suivi cellulaire à l’aide de l’IRM a suscité une immense attention au cours des dernières années, non seulement pour les immunologistes qui étudient le comportement des cellules immunitaires in vivo, mais aussi pour les chercheurs cliniques et les chercheurs sur les cellules souches. Au milieu des années 90, les premières études sur les nanoparticules d’oxyde de fer ¹ ont déclenché une cascade de développements pour le suivi des cellules par IRM. Les particules d’oxyde de fer raccourcissent le temps de relaxation IRM (T2*) des cellules marquées et provoquent ainsi l’épuisement du signal dans les images IRM. Les particules d’oxyde de fer ont été utilisées pour marquer les macrophages ², les progéniteurs d’oligodendrocytes ³ et de nombreux autres types de cellules. Certaines de ces particules ont également été cliniquement approuvées par la FDA pour l’étiquetage des vaccins cellulaires chez les patients atteints de mélanome ⁴. Étant donné que le marquage in vivo ou ex vivo des cellules avec des particules d’oxyde de fer repose sur un raccourcissement du signal T2* et que ce dernier pourrait également être provoqué par des effets T2* liés à la susceptibilité in vivo tels que des micro-saignements, des dépôts de fer ou des bulles d’air, il pourrait être difficile d’identifier les cellules marquées in vivo à partir d’autres extinctions du signal T2* de fond ⁵.

Dans cet article, nous décrivons une technique de suivi des cellules dendritiques (DC) in vivo en utilisant l’imagerie par résonance magnétique (IRM) ¹⁹F/¹H. Cette technologie de suivi cellulaire n’a été introduite qu’en 2005 ⁶, plusieurs années après que les premières applications reconnues du ¹⁹F en IRM aient été signalées ⁷. Un avantage important du ¹⁹F par rapport au marquage cellulaire des particules d’oxyde de fer est la faible occurrence biologique du ¹⁹F dans les tissus ; Cela permet de suivre les cellules de manière très sélective avec des images pratiquement sans arrière-plan. De plus, il est possible de superposer le signal IRM ¹⁹F des cellules marquées transplantées avec des images anatomiques obtenues à partir d’IRM 1H conventionnelles. ¹⁹L’IRM F/¹H est donc considérablement pertinente pour les études portant sur la migration cellulaire in vivo. Les cellules étudiées avec cette méthode sont marquées avec ¹⁹particules riches en F. Les perfluorocarbures (PFC) d’origine synthétique, constitués principalement d’atomes de carbone et de fluor, sont couramment utilisés pour préparer les particules. Ces composés sont insolubles dans l’eau et doivent être émulsionnés avant d’être appliqués in vitro ou in vivo. La taille habituelle des particules PFC qui ont été utilisées par d’autres groupes pour les expériences de suivi in vivo ¹⁹F-MRI varie entre 100 nm et 245 nm ^6,8-10. Nous avons cependant montré que l’efficacité du marquage des cellules dendritiques avec des particules de perfluoro-15-couronne-5-éther (PFCE) augmente avec l’augmentation de la taille des particules (>560 nm). ¹¹

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux doivent être approuvés par le comité local des animaux des établissements bien-être avant l'exécution. Pendant les mesures MR un niveau adéquat d'anesthésie et le monitorage physiologique (température du corps, rythme respiratoire) sont des conditions indispensables.

1. Génération de moelle osseuse de souris des cellules dendritiques dérivées

1. Extrait cellules de moelle osseuse de souris C57BL / 6 tel que décrit précédemment ^12. Ce protocole remonte à 1992 ¹³ et a été initialement décrite par le groupe de Ralph M. Steinman (1943-2011), découvreur de la cellule dendritique ^14.
2. En bref, extraire tibia et du péroné peu de temps après sacrifier des souris. Travaillant sous la hotte à flux laminaire (pour éviter la contamination microbienne), rincer la moelle osseuse dans une petite boîte de Petri avec un milieu de lavage (5% de FBS, HEPES 1% de pénicilline / streptomycine et 1% dans du RPMI) ^12.
3. Transférer la suspension cellulaire à travers une stra celluleiner (100 um de maille, de nylon) dans un tube à centrifuger de 50 ml stérile afin de retirer les os et les tissus restants. Après plusieurs étapes de lavage et une étape de lyse ^12, compter le nombre de cellules viables en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre.
4. Resuspendre les cellules de moelle osseuse à une concentration de 400.000 cellules ml ^-1 dans le milieu de culture (RPMI supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine, HEPES 1% et 1% de L-glutamine) contenant 75 ng ml ^-1 de la souris granulocytes macrophage-colony stimulating factor (mGM-CSF) obtenu à partir de surnageants de cellules HEK transfectées avec un 293FT GMCSF souris plasmide. Transférer 10 ml de suspension cellulaire (4 x 10 ⁶ cellules) dans des boîtes de Pétri (100 mm x 20 mm) et incuber dans un incubateur à CO ₂ (37 ° C, 5% CO _2). Au jour 3, reconstituer ancien milieu avec 10 ml de milieu frais (en gardant concentration finale de mGM-CSF à 75 ng ml ^-1). Au jour 6, enlever 10 ml de milieu de vieux et de reconstitueravec 10 ml de milieu frais (concentration finale mGM-CSF = 75 ng ml ^-1). Au jour 8, enlever 10 ml de milieu de vieux et de reconstituer avec 10 ml de milieu frais (concentration finale mGM-CSF = 150 ng ml ^-1).
5. Au jour 10, le DC matures différenciées avec 1 pg ml ^-1 lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 heures.

2. Étiquetage des cellules dendritiques avec ¹⁹ F-particules riches en

1. Au cours de l'étape de maturation h 24 (1.5), l'étiquette du DC avec 1 mM de fluor riche perfluoro-15-couronne-5-éther (PFCE) des particules (500-560 nm) également pour 24 heures. Préparer de grandes particules marquées par du fluor émulsifiant PFCE en Pluronic F-68 (volume total 2,5 ml) en utilisant une sonotrode cellule de perturbation de titane et l'emploi d'un programme d'impulsion continue (100% d'amplitude, puissance = 250 W) pendant 60 secondes.
2. En suivant les étapes d'incubation ci-dessus, la mûre et la récolte du fluor marqué DC en utilisant une culture de cellules de tissu racloir, le transfert dans un tube à centrifuger de 50-ml et centrifugerà 500 g pendant 5 min à température ambiante.
3. Pour laver les particules de restes et les cellules mortes, sans toucher aux cellules récoltées à adhérer sur la poly-L-lysine plats. Pour se préparer à cette étape, manteau boîtes de Pétri avec du poly-L-lysine (1 mg ml ^-1) à 37 ° C pendant 1 heure, puis laver la non liée poly-L-lysine avec du PBS.
4. Incuber les cellules récoltées ci-dessus sur les plaques de poly-L-lysine dans un milieu sans sérum et permettre aux cellules d'adhérer (1 heure à 37 ° C, 5% CO _2).
5. Laver le support de jeter cellules non adhérentes, les particules restantes et les cellules mortes et laver trois fois avec pré-chauffé (37 ° C) PBS.
6. Récolte des cellules adhérentes par un traitement la trypsine-EDTA (0,25% de trypsine-EDTA, 3 minutes d'incubation à 37 ° C).
7. Suite à une autre étape de centrifugation de lavage, remettre en suspension la quantité requise de cellules dendritiques matures dans le sérum sans PBS stérile.
8. Pour déterminer si les cellules ont été étiquetée correctement, il est recommandé de vérifier la physicochemiques caractéristiques des cellules par cytométrie en flux (FACS). La dispersion latérale (SSC) devrait révéler une granularité accrue dans ces cellules, comme décrit précédemment ^11. Il convient également de garder à l'esprit que les fibroblastes pourraient contaminer les cultures DC et pourrait également prendre les ¹⁹ particules F en parallèle. Par conséquent, la pureté DC doit être évaluée (en mesurant le pourcentage de CD11b ⁺ CD11c ⁺ en utilisant des cellules FACS) avant application in vivo.

3. Application in vivo de ¹⁹ F-étiquetés cellules dendritiques

1. Administrer à courant continu ⁽¹⁰ juin-10 juillet) dans un volume de 50 à 100 pl intracutanée dans les pattes arrière d'une souris C57BL / 6 par le positionnement de la souris dans un support et soigneusement insertion d'une aiguille 26 G ½ dans les couches supérieures de la peau avant l'application (utilisation des seringues à tuberculine 0,5 ml avec aiguilles attachées en permanence pour minimiser le volume mort). Afin d'assurer uned'application n intracutanée appropriée, il est important que la partie de l'aiguille insérée être partiellement visible sous la peau. Si l'aiguille n'est pas plus visible, l'aiguille a été insérée trop profondément dans les couches de la peau. Pour l'individu non averti, l'application intradermique pourrait être réalisée sous anesthésie.
2. L'image des membres par le fluor vivo ⁽¹⁹ F) / proton ⁽¹ H) IRM (voir la section suivante) 21 h suivant l'injection.

4. In Vivo ¹⁹ F / ¹ H imagerie par résonance magnétique

Les instructions détaillées pour configurer les scans IRM se référer à un scanner Bruker MR en utilisant le logiciel de contrôle Paravison (version 5.1). Dénominations faisant référence à des fournisseurs fonctions spécifiques et des articles ont été mis en évidence en italique. Pour les scanners IRM autres de ces étapes peut être ajustée selon les directives du fabricant.

1. Prévoir un accès dédié à unpetit animal MR scanner. Pour une qualité d'image suffisante, un système avec une intensité de champ magnétique de 9,4 Tesla ou plus et sur ​​mesure bobines de radiofréquence (par exemple ¹ H / ¹⁹ F à double bobine RF accordable volume, de 35 mm de diamètre intérieur, 50 mm de longueur; rapide Biomed, Würzburg, Allemagne) sont recommandés.
2. Avant d'IRM, de préparer la mise en place de l'IRM pour l'anesthésie et la surveillance physiologique. Assurez-vous que le masque respiratoire de l'animal lit / support est relié au système de l'isoflurane et que la sonde de température et le pad respiration sont connectés à un système de surveillance à distance des animaux (par exemple, modèle 1025, SA Instruments Inc, New York, USA). Ce dernier sert à surveiller les paramètres vitaux de l'animal tels que la température du corps et la respiration.
3. Anesthésier les souris par narcose par inhalation en utilisant une chambre de souris reliée à un système d'isoflurane. Régler le débit d'air et O ₂ à 0,2 L min ^-1 et 0,1 L ^-1 min, respectivementet 3% d'isoflurane (ajusté d'un vaporisateur) pendant environ 2 minutes jusqu'à ce que le niveau requis est atteint d'anesthésie (pas de pincement de l'orteil réponse suivante). Débits optimaux peuvent varier selon la configuration utilisée. Soyez conscient que des débits élevés pourraient conduire à une déshydratation. Une surveillance attentive des conditions des animaux est nécessaire en tout temps comme mentionné ci-dessus.
4. Positionnez la souris à plat ventre sur le lit de la souris / titulaire du petit animal MR scanner (figure 1).
5. Tout en maintenant le débit d'air constant et O _2, ajuster le vaporisateur isoflurane à 0,8 à 1,5% jusqu'à une respiration optimale est atteinte. Une fréquence respiratoire de 50 à 70 respirations par minute est recommandée.
6. Maintenir la température du corps à 36-37 ° C pendant l'expérience en utilisant de l'eau chaude (ou de l'air chaud alternativement) système de circulation.
7. Gardez les yeux humides de la souris avec pommade ophtalmique lubrifiante stérile pendant la mesure.
8. Après avoir obtenu l'animalsur le support de formation d'image et les connexions au système de surveillance, déplacer le support vers le centre de la ¹ H / F bobine RF ¹⁹ (qui est positionné au niveau de l'isocentre de l'aimant du scanner animal).
9. Régler la position de la souris telle que le genou se trouve dans l'isocentre de l'aimant, soit avec une méthode automatisée (par exemple en utilisant un laser de positionnement combiné à un support entraîné par un moteur animale) ou manuellement par le calcul de la distance de la porte doit être déplacée dans l'aimant d'atteindre l'isocentre.
10. Pour confirmer le positionnement correct de l'animal dans le scanner, puis la planification de la géométrie coupe d'image (taille-dire, la position et la rotation dans l'espace), acquérir des images éclaireur dans trois orientations standard (axiale, coronale, sagittale) en utilisant image à résolution rapide et peu Modes d'acquisition (par exemple TriPilot protocole, qui utilise une séquence d'impulsions flash).
11. Accorder la bobine RF à la fréquence de résonance ¹ H (par exemple. 400,1 MHz pour 9,4 T) et à la fréquence de résonance F ¹⁹ (par exemple 376,3 MHz pour 9,4 T) et correspondent à l'impédance caractéristique de la bobine de 50 ohms à l'aide du moniteur d'accord du scanner animale MR. Réglage et mise en correspondance est nécessaire pour atteindre les conditions optimales pour la transmission et la réception du signal.
12. Effectuez les réglages nécessaires automatiques du système, y compris le calage d'affiner l'homogénéité du champ magnétique (par exemple ADJ_SHIM), des ajustements de fréquence pour régler le système RF à la fréquence Lamor de la souris (par exemple ADJ_SF) et le gain de référence pour ajuster l'amplitude RF ( par exemple ADJ_REFG). Tous ces paramètres sont importants pour que les champs statiques et variables magnétisme (B _0, B ₁₎ dans la région d'intérêt le plus homogène possible.
13. Acquérir un deuxième ensemble d'images scouts (voir plus haut) le long des trois axes orthogonaux, après avoir ajusté le champ de vision (FOV) de telle sorte que les deux membres inférieurs are visible de bassin à pied (L xlx H = 50x25x25 mm). Ces images servent à planifier les orientations des scans 3D finale F ¹ H / ^19.
14. Mettre en place un protocole TurboRARE 3D pour ¹ H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, facteur RARE = 16 (. Env 60 min de balayage). Ajustez FOV avec l'aide des images de repérage, lancer le scan (feux de circulation).
15. Charger une impulsion unique FID-séquence avec un TR d'au moins 1.000 ms. Ouvrez balayage Modifier et mettre le noyau à ¹⁹ F. Utilisez les réglages de gain manuel en désactivant le gain automatique de la référence à la méthode d'édition de la boîte à outils.
16. Démarrage de la mesure sans enregistrer les données à afficher un signal MR en temps réel en utilisant le SGP (aller configuration). Si le signal ¹⁹ F spectrale dans la fenêtre d'acquisition est trop bas, ajouter d'autres moyennes dans la méthode d'édition et / ou de moduler l'atténuateur d'impulsion (TX0 ou le curseur SP0) jusqu'à ce qu'un signal est clairement visible. Ajuster la fréquence de base de manière à centrer le pic spectral F ¹⁹ à 0 Hz dans la fenêtre d'acquisition. Appliquer fréquence de base et d'arrêt de presse. Notez que l'isoflurane utilisé comme anesthésique peut générer un signal de fond. À 9,4 Tesla IRM du déplacement chimique entre les ¹⁹ F contenant des particules et de l'isoflurane est d'environ 1800 Hz. Assurez-vous que la bande passante d'excitation est inférieure à 3600 Hz pour éviter l'excitation du isoflurane ensemble avec les ¹⁹ cellules F-étiquetés ou des particules. La fréquence de base doit être correctement réglée sur le signal généré par les ¹⁹ cellules F-étiquetés. Une autre méthode d'anesthésie pourrait être utilisé comme l'expérimentateur lui semble.
17. Clone (copie) le protocole TurboRARE 3D à partir de l'analyse précédente ¹ H. Allez dans Edition Méthode et désélectionnez le gain automatique de la référence (ci-dessus). Set ¹⁹ noyau de F Edition Scan. Changer la matrice de 128x64x64et l'. RARES facteur d'au moins 40 (jusqu'à 64) Pour une msec TR / TE 1000/6 et 64 moyennes, le temps de cycle est d'environ 70 min. Réglez le gain du récepteur à 101 (boîte à outils) et lancer la numérisation sans autres ajustements à l'aide GOP (aller pipeline).
18. Lorsque les analyses sont terminées rentrer le porte-souris de l'IRM. Débranchez la souris soigneusement de son support. Si la souris ne soit pas sacrifiée pour l'analyse ex vivo (par exemple, l'histologie ou la spectroscopie, voir ci-dessous) directement après les mesures IRM, suivre de près jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré de l'anesthésie. Régulation de la température du corps est touchée par l'anesthésie, donc pendant le processus de récupération, placez la souris dans une cage séparée qui est placé sur une chaude température régulée pad. Une fois que la souris a complètement récupéré de l'anesthésie, il retourne dans sa cage et tenue à la salle des animaux.
19. Pour superposer les ¹⁹ images F à ¹ H des images, utilisez le menu Affichage option sur le même logiciel (Paravison). La fonction de sous-couche peut être trouvé sous corrélation. Enregistrer la sous-couche, de charger la nouvelle image et sélectionnez la couche ¹⁹ F en définissant une nouvelle couleur dans la table de consultation. Faire la distinction entre les ¹⁹ scans H F et ^1, modifier le seuil de la couleur choisie (coupé Look Up Table) de sorte que le signal ¹⁹ F aura la couleur choisie et le fond ¹ image H restera en niveaux de gris. D'autres programmes de post-traitement (par exemple ImageJ) sont disponibles pour créer les ¹ H / ¹⁹ F superpositions d'image.
20. Si une quantification in vivo du signal ¹⁹ F nécessaire, suivre un protocole simple quantitative comme décrit précédemment ^15,16. En bref, la quantification peut être fait en plaçant un tube de référence avec une concentration connue de PFCE-émulsion dans le champ de vision à côté de la souris. Après l'acquisition de l'image MR, quantifier les intensités des ¹⁹ signaux en utilisant F région d'intérêt (ROI) d'analyse et de comparer à la courbe d'étalonnage en vitro comme le montre la figure 2.

5. Des ganglions lymphatiques de la spectroscopie par résonance magnétique (SRM)

1. Après avoir sacrifié la souris, retirez le ganglion lymphatique poplité et le placer dans un petit tube de 5 mm RMN et ajouter 100 ul de 2% de PFA.
2. Installer une bobine ¹⁹ F spectroscopie (par exemple une bobine toroïdale) qui présente une ouverture d'au moins 5 mm pour maintenir le tube RMN contenant le ganglion lymphatique.
3. Placer le tube de RMN à l'intérieur de la bobine et déplacer la bobine dans l'isocentre de l'aimant.
4. Accorder la bobine RF à la fréquence de résonance F ¹⁹ (par exemple 376,3 MHz pour 9,4 T) et correspondent à l'impédance caractéristique de la bobine de 50 ohms à l'aide du moniteur d'accord du scanner animale MR. Réglage et mise en correspondance est nécessaire pour atteindre les conditions optimales pour la transmission et le signalréception.
5. Régler tous les paramètres de calage à l'intérieur de la boîte à outils Calage à 0 et appuyez sur appliquer. Habituellement, il n'est pas nécessaire d'appliquer des méthodes de calage puisque le volume de l'échantillon est relativement faible. Si un nombre suffisant ^de signaux ¹⁹ F est disponible, méthodes automatisées peuvent être appliquées pour la fréquence du système de calage, et le gain du récepteur comme décrit ci-dessus.
6. Charger une impulsion unique avec une séquence FID TR d'au moins 1.000 ms. Ouvrez Modifier Scan et mettre le noyau à ¹⁹ F. Utilisez les réglages de gain manuel en désactivant le gain automatique de la référence à la méthode d'édition de la boîte à outils. Définissez le nombre de moyennes à 1.
7. Démarrer la séquence en utilisant le SGP. Si le signal ¹⁹ F spectrale dans la fenêtre d'acquisition est trop bas, ajouter d'autres moyennes dans la méthode d'édition et / ou de moduler l'atténuateur d'impulsion (TX0 ou le curseur SP0) jusqu'à ce qu'un signal soit clairement visible. Réglez la fréquence de base de sorte que la spé ¹⁹ Fctral pic est au centre de la fenêtre d'acquisition à 0 Hz et s'applique fréquence de base. Ajuster à nouveau l'atténuateur d'impulsions afin de maximiser le signal, pour atteindre 90 ° d'excitation. Lorsque le signal est à l'arrêt presse maximale.
8. Définissez les moyennes dans la méthode Editer entre 64 et 256 (ou plus si nécessaire, en fonction du signal) et lancer l'acquisition à l'aide du GOP. Le signal détecté est corrélé de façon linéaire avec le nombre de moyennes. Lors de la quantification garder à l'esprit que le signal détecté doit être normalisé à une moyenne. En outre, un étalon de concentration connue ou une courbe d'étalonnage est nécessaire de calculer le nombre de cellules de la normalisation du signal F ¹⁹ (figure 2).
9. Une fois l'analyse terminée, retirez l'échantillon, placer l'échantillon suivant et passez à l'étape 5.3.

Résultats

Dix-huit à vingt et un heures suivant l'application intradermique, ¹⁹ F-étiquetés cellules dendritiques (DC) migrent dans le ganglion lymphatique poplité drainant. Le mouvement des DC via les canaux lymphatiques dans le ganglion drainant politeal peut être apprécié par superposition des images ¹ H anatomiques avec les ¹⁹ images DC F (figure 2A). Nous avons déjà fait état ​​de la migration de ces cellules in vivo, ainsi que l'impact de la ¹⁹ F-...

Discussion

Cette méthode d'employer ¹⁹ F / ¹ H IRM pour suivre le mouvement de DC dans le ganglion lymphatique donne l'occasion d'étudier les schémas de migration des cellules immunitaires in vivo. Les cellules dendritiques sont d'excellents exemples de la migration rapide des cellules immunitaires qui sont capables de manœuvrer à travers des structures tridimensionnelles sans bien adhérentes à des substrats spécifiques ^17. Bien que la faible résolution spatiale (échelle du...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			REACTIFS
Souris C57BL / 6	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS supérieure	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco Invitrogen-	15630-056
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140-122
L-glutamine	Gibco	25030-024
PBS Dulbecco	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
Perfluoro-15-couronne-5-éther	ChemPur	391 -1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
Des boîtes de Pétri (35 x 10 mm)	VWR, Allemagne	391-1996
27 ½ seringues G	VWR, Allemagne	612-0151
Tamis en nylon de cellules um (100 mesh)	VWR, Allemagne	734-0004
RMN tubes	VWR, Allemagne	634-0461
			ÉQUIPEMENT
Outils de dissection	FST
Incubateur à CO 2	Liant
Petit animal MR système	Bruker BioSpin		9.4T BioSpec 94/20 USR,Acquisition ParaVision et de logiciels de traitement
1 H / 19 F à double bobine RF accordable de volume	Rapid Biomed, Würzburg, Allemagne		35 mm de diamètre intérieur, 50 mm de longueur
19 bobine spectroscopie F	interne		air / match bobine en boucle, 4 tours, diamètre intérieur 5 mm, 10 mm de long, deux condensateurs pour le réglage et l'appariement
Système d'inhalation d'isoflurane	Föhr Medical Instruments GmbH
Modèle du système de surveillance des animaux 1025	SA Instruments Inc, New York, USA