Analyse des embryonnaire et larvaire de poisson-zèbre squelettiques fibres musculaires de préparations dissociées

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé chargé de générer les forces nécessaires à la motilité contractile. Contraction est initiée par un processus connu sous le nom excitation-contraction (CE) de couplage qui convertit les signaux électriques à la libération de calcium des réserves intracellulaires ^1,2. La libération de calcium intracellulaire active le sarcomère à raccourcir et à générer de la force. Les nombreux éléments spécifiques de la machinerie moléculaire responsable de la médiation transmission de la jonction neuromusculaire ^3, le couplage CE ^4,5, et l'actine-myosine contractions dépendantes ⁶ continuent à être l'objet permanent de recherche intense. En outre, les protéines qui stabilisent la membrane du muscle lors de la contraction ^{de 7,8} et que la signalisation entre le myofiber et la matrice extracellulaire ^7,9 médiate ont été identifiés et étudiés dans les moindres détails.

Des mutations dans un certain nombre de gènes importants pour la structure d'un musclefonction e ont été identifiés comme causes de maladies musculaires squelettiques humaines ( http://www.musclegenetable.org/ ). Ces maladies, classés largement que myopathies squelettiques et les dystrophies musculaires basés sur les caractéristiques cliniques et histopathologiques, sont associées à une faiblesse musculaire, une incapacité permanente, et au début de ^10,11 de mortalité. Le poisson zèbre s'est avéré être un excellent système pour la modélisation et l'étude des maladies des muscles squelettiques humains ^8,12,13. Il a été utilisé pour valider de nouvelles mutations génétiques ^8, définir de nouveaux aspects de la maladie physiopathologie ^14,15, et d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques ^15,16. La puissance de poisson zèbre pour étudier la maladie du muscle humain concerne le grand nombre d'enfants, le développement rapide de la structure musculaire et de la fonction, la clarté optique de l'embryon de poisson zèbre, et la facilité de la manipulation génétique et pharmacologique du zèbre en développementpoissons ^17.

Nous et les autres ^12,18,19 avons récemment développé une technique simple pour l'isolement rapide et efficace des fibres musculaires du poisson zèbre en développement. Cette méthodologie a permis l'examen des fibres musculaires plus en détail que peut être fournie par l'analyse de l'embryon entier. La technique a été exploitée pour la caractérisation de la protéine ²⁰ localisation sous-cellulaire ainsi que pour l'identification des caractéristiques histopathologiques importants dans le cadre d'études de validation dans des modèles de maladie nouvellement mis au point ^21. En outre, les fibres musculaires isolées peuvent en outre être utilisés pour l'imagerie en direct et pour les études électrophysiologiques ^22, les techniques qui permettent d'interroger les principaux aspects de la fonction musculaire. Le protocole spécifique pour l'isolation des fibres musculaires, ainsi que deux exemples d'expériences analytiques ultérieurs, est détaillé dans les parties restantes de ce manuscrit.

Une. lamelles de préparation de poly-L-lysine couché (Durée: 1 h)

lamelles de revêtement permet le tassement des fibres musculaires rapides et l'adhérence. Cela peut être effectué au cours de l'étape de dissociation de l'isolement de fibres musculaires (étape 2 ci-dessous).

1. Couper et placer Parafilm sur le fond d'un plat de 60 mm de Pétri (toute marque).
2. Placer des bordereaux de verre de couverture de microscope (diamètre 12 mm) sur Parafilm dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm ou de les placer individuellement dans des puits individuels de plaques à 24 puits.

Note 1: Ces petites lamelles rondes aident à concentrer le nombre des fibres musculaires et réduire l'utilisation de l'excès d'anticorps.

Note 2: D'autres lamelles de taille vont travailler, mais les volumes de réactifs et d'embryons utilisés devront être ajustés en conséquence.

3. Introduire à la pipette 50 à 200 ul de solution de poly-L-lysine (0,01%) sur chaque lamelle couvre-objet dans la boîte de Pétri.
4. Autoriser les lamelles de s'asseoir au moins un hour à 37 ° C. Incubations plus longues ne seront pas influencer négativement les résultats.
5. Retirer poly-L-lysine solution du couvercle en verre et laver deux fois avec un minimum de 100 pi 1x PBS.
6. Permettre aux lamelles de sécher.
7. Lamelles sont maintenant prêts pour les fibres musculaires.

Note 3: Afin de garantir la stérilité, le revêtement peut être fait dans une hotte et sur des lamelles en autoclave.

Note 4: Gardez la boîte de Pétri de 60 mm avec du Parafilm sur le fond. Cette configuration sera utilisée pendant myofiber placage et immunomarquage (plus tard étapes).

Variante 1: Au lieu de lamelles de revêtement immédiatement avant de les utiliser, une lamelle de papier couché peut être utilisé. Un plat de 60 mm de Pétri contenant un minimum de 2 ml de poly-L-lysine peut être conservé à 4 ° C contenant de nombreuses lamelles. Avec cette alternative commencer à l'étape 1.5 pour traiter les lamelles de fibres musculaires.

Alternative 2: Nous avons également des lamelles de manteau en poly-L-ornithine. Tson est plus de travail, mais est utile pour plus de culture terme parce lamelles revêtues de poly-L-ornithine peut être traité anti-UV. Avec un traitement UV et technique stérile attention myofibers vivants peuvent généralement être maintenues en culture provenant 4-7 jours.

2. La dissociation des embryons de poisson zèbre et de placage de fibres musculaires (Durée: 1 à 3 heures)

Remarque: le protocole standard s'applique le mieux à 3 dpf (jours après la fécondation) des embryons.

1. Transfert d'embryons de poisson zèbre dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse standard et éliminer autant d'eau de poissons excès que possible. Typiquement, 10 à 20 embryons par tube, bien que moins peuvent être utilisés. Utilisation de plus de 20 à 25 embryons se traduit souvent par une préparation de densité excessive.
   1. Retirer chorions avant dissociation, manuellement à l'aide # 5 forceps. En variante, l'élimination du chorion chimique est réalisée avec un traitement Pronase 10-15 min. En règle générale, la suppression de la précédente chorion n'est nécessaire que si la confirmation préalable d'un mutphénotype fourmi ou la morphologie est nécessaire, ou lorsque vous utilisez les stades où les embryons sont naturellement éclosion de leur chorion.
2. Ajouter 900 pi de CO ₂ médias indépendants dans le tube contenant les embryons.
3. Ajouter 100 pi de type II de la collagénase, concentration finale de 3,125 mg / ml (solution mère de la collagénase à 31,25 mg / ml dilué dans du PBS 1X) pour commencer la dissociation. Collagénase IV peut également être utilisé pour la dissociation.
4. Faire tourner les embryons sur un agitateur orbital, et triturer toutes les 30 min à température ambiante en utilisant un Pipetman P1000 pour la trituration.

Note 2: Surveiller attentivement embryon dissociation; plus ou moins de dissociation (surtout plus) sont les raisons les plus fréquentes de l'échec du protocole. Temps pour la digestion varie en fonction de l'intensité de trituration, nombre d'embryons par tube, et l'âge de l'embryon. Il est également souvent moins (par rapport au type sauvage) à partir d'embryons mutants du muscle squelettique.

Remarque3: temps de digestion moyen par âge de l'embryon: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h et 4 dpf = 2-2,5 h.

5. Arrêtez la digestion quand aucun des embryons entiers sont visibles, mais des morceaux solides sont encore visibles - ce qui est essentiel pour éviter une digestion excessive.
6. Tubes à centrifuger avec des embryons dissociées à 0,8 à 2,3 g pendant 3-5 min à culot de cellules.
7. Retirer le surnageant de culot de cellules et laver 2x CO ₂ médias indépendants.
8. Ajouter CO frais ₂ médias indépendants à remettre les cellules. 1 ml est généralement utilisé pour préparations de 10-20 embryons. Le volume peut être adapté en fonction du nombre d'embryons.
9. Avec une pipette P1000, passer embryon suspension à travers un filtre de 70 um. Cela permet de supprimer les débris indésirables de la préparation.

Note 4: Embryon suspension peut être filtrée une seconde fois à travers un filtre de 40 um pour éliminer davantage les débris indésirables. D'une double filtration, la récupération est approximdiatement 800 ul d'un volume initial de 1 ml.

10. Ajouter environ 50 à 100 ul de suspension de fibres musculaires à chaque lamelle couvre-objet revêtues de poly-L-lysine.

Note 5: Effectuer l'étape 2.9 dans les boîtes de Pétri avec du Parafilm sur le fond, préalablement préparé. Le Parafilm maintient la suspension de fibres musculaires de courir au large des lamelles recouvertes. Gardez boîtes de Pétri couverts pour éviter l'évaporation.

11. Permettent de régler les fibres musculaires d'environ 1 heure sur les lamelles recouvertes à la température ambiante.

Note 6: les fibres musculaires commencent à s'installer dans 5-10 min. Cependant, pour une bonne fixation de fibres musculaires, un minimum de 1 heure (1-2 heures) est recommandé. Permettre fibres musculaires à se contenter de plus ne nuira pas à la préparation. Pour les incubations plus longues (y compris la nuit), les antibiotiques peuvent être ajoutés aux médias. Avec des antibiotiques et technique stérile cultures vivantes peuvent généralement être conservés pendant 1-2 jours.

12. Direct myofibers peut être observé à ce stade. Fibres musculaires à partir d'embryons 2 dpf et plus tard sera considéré comme cellules striées et allongées (figure 1). À ce stade, les fibres musculaires sont maintenant prêts pour l'analyse en temps réel ou pour immunomarquage.

Note 7: Le muscle squelettique de 1 dpf embryons ne pas plaquer les fibres allongées et clairement que striés. Au lieu de cela, les grandes myoballs sont visibles. En outre, au cours de l'après dissociation de phase de granulation (étape 2.6), 1 dpf myoballs doivent être centrifugé pendant un minimum de 8 min à 5000 xg pour obtenir une pastille. Pour l'analyse des embryons à ce stade, il est recommandé d'utiliser la lignée transgénique exprimant EGFP spécifiquement dans le muscle squelettique ^23. Ceci permettra l'identification des cellules d'origine musculaire par rapport à d'autres sources.

3. Fluorescence Immunocoloration dissociées de poisson-zèbre fibres musculaires (Durée: environ 1 jour)

3.1. Immunomarquage

1. Retirez une partie demédias de fibres musculaires adhéré à la lamelle enduit
2. Fixer les cellules en utilisant 4% de paraformaldéhyde ou le méthanol. Pour PFA, retirez ½ le volume des médias et la remplacer par la même quantité de PFA. Fixer pendant 10 min à température ambiante, puis retirez volume total, le remplacer par 50-100 ul de PFA, et fixer pour 10 min de plus. Pour la fixation de l'alcool, de la glace ou de l'acétone methanol froid peut être appliqué à 4 ° C pendant 10 min ou 5 min, respectivement.
3. Laver les fibres musculaires au moins 3-5x avec PBS 1x ou 1x PBS plus 0,1% de Tween. Volume de lavage moyenne est de 50-100 ul par lamelle.
4. Ajouter une solution de blocage de fibres musculaires (langue de travail) et incuber 20-60 min à température ambiante. La solution de blocage varie en fonction de l'anticorps primaire et secondaire. Les deux plus couramment utilisé dans le laboratoire sont (1) 1x PBS, 2 mg / ml de BSA, sérum de mouton de 1%, 0,25% de Triton X-100 final et (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) et 5% de sérum ovins / caprins.
5. Retirer la solution de blocage et ajouter anticorps primaire dilué dans les deux bsolution PBS ou de verrouillage. Incuber myofibres pendant une nuit à 4 ° C. Assurez-vous que soit Parafilm ou l'envelopper dans du Saran la boîte de Pétri contenant les lamelles de fibres musculaires chargé recouvertes d'anticorps. De petits morceaux de serviettes en papier humidifiées peuvent être ajoutées pour créer une chambre humidifiée.
6. Eliminer l'anticorps primaire de lamelles et laver lamelles 3-5x pendant 5 min avec du PBS ou solution de blocage.
7. Ajouter anticorps secondaire à une concentration appropriée dilué dans PBS 1x ou solution de blocage pendant 1-2 heures à la température ambiante.
8. Eliminer l'anticorps secondaire et laver les fibres musculaires 3-5x dans du PBS pendant 5 min chaque à température ambiante.

3.2. Des lamelles de montage

9. Appliquer 1-2 gouttes de réactif de antifade sur une lame de microscope.
10. Pick-up soigneusement la lamelle enduit et immunolabled aide d'une pince et le lieu (fibres musculaires vers le bas) de la lamelle sur le réactif de antifade sur la lame de microscope.

Remarque 1: Attention à l'orientation de la clamelle oated est critique.

11. Posez 1-2 Kimwipes sur une surface solide dur. Inverser rapidement la lame avec les lamelles recouvertes reposant sur le réactif de antifade et placez-le (lamelle vers le bas) sur la Kimwipes.
12. Appliquer une légère pression sur les coins de la lame de microscope pour éliminer l'excès antifade et former un joint étanche entre la lame et lamelle
13. Permettre la antifade restant à sécher pendant 5-10 min à température ambiante, puis les fibres musculaires sont prêts à l'image (Figures 2A et B) ou conserver à 4 ° C.

4. Imagerie de cellules vivantes de calcium Utilisation GCaMP3

Expériences sur des cellules vivantes peuvent être effectuées sur les fibres musculaires avant la fixation (ci-après l'étape 2.10). Le protocole suivant décrit l'imagerie en direct dans les fibres musculaires exprimant GCaMP3 ^24, un indicateur de calcium codé génétiquement, exprimée par le α-actine poisson zèbre promoteur spécifique du muscle squelettique (PSKm) ^23. Autrement,cette technique peut facilement être adapté pour utiliser des colorants indicateurs de calcium tels que Fura-2.

1. Injecter embryons de PSKm: GCaMP3 construire au stade 1-2 cellules
2. A 3 dpf, recueillir les larves et préparer les fibres musculaires comme décrit dans les sections 1 et 2. Permettre aux fibres musculaires d'adhérer pour un minimum de 1 heure. Pour cette technique, la préparation des lamelles dans des boîtes de 24 puits sont nécessaires.
3. Retirez délicatement le support en trop, et ajouter 300 ul de frais CO ₂ médias indépendants à la température ambiante.
4. Respecter les cellules sous un microscope inversé. Myofibres positives GCaMP3 doivent être visibles sous fluorescence verte.
5. Mettre en place la caméra pour l'enregistrement, si vous le souhaitez.
6. Préparer une solution de caféine 30 mM de CO ₂ médias indépendants. Pour stimuler les cellules, la pipette doucement 300 pi de solution de caféine dans le puits à la loupe. Dans 5-10 sec, les fibres musculaires positives GCaMP doivent répondre à la caféine à une augmentation rapide de la fluorescence (figure 3). Myofibteurs peuvent aussi contracter. Fait à noter, la caféine induit la libération de calcium dans les magasins du réticulum sarcoplasmique ^25. D'autres agents, tels que KCl ²⁶ et ryanodine ^4, peuvent être utilisés pour étudier la libération de calcium inductible.

Immunomarquage fluorescent de fibres musculaires (figure 2)

Images montrant motif de marquage fluorescent attendu de fibres musculaires immunocolorées après isolement succès et le placage. Les fibres musculaires ont été marquées avec soit anti-récepteur de la ryanodine (1:100) (figure 2A) ou l'anti-α-actinine (1:100) (Figure 2B), les anticorps, et révéler l'immunomarquage de la triade et le Z-bande, respectivement. Anticorps secondaires utilisés étaient Alexa Fluor 555 (1:500). Les images capturées en utilisant la microscopie confocale.

La libération de calcium induite par une myofibrille (Figure 3)

série de panneau montrant la libération de calcium représentant d'une des fibres musculaires isolées traités à la caféine. En bref, les embryons de poisson zèbre ont été injectés au stade d'une cellule à l'PSKm: GCaMP3 construction. A 3 dpf, les embryons ont été dissociées et étalées comme décrit dans le protocole. Pour l'analyse, les fibres musculaires exprimant GCaMP3 ont été sélectionnés, comme indiqué par la présence d'une fluorescence verte à l'inclusion. En utilisant une micropipette pour l'administration du médicament, la fibre sélectionnée a été baigné dans une solution 30 mM de caféine pour induire la libération de calcium. L'enregistrement vidéo a été lancé avant l'application de la caféine et a continué jusqu'à ce pic de fluorescence a été atteint. Cette figure démontre la caféine induit la libération de calcium normal, et la technique peut être utilisée pour interroger le dispositif de couplage excitation-contraction par imagerie en temps réel.

Figure 1. Chronologie schématique de l'embryon de dissociation. Des panneaux successifs (de haut en bas) illustrent différentes étapes, le calendrier et l'équipement requis pour l'embryon dissociation. A) sélection d'embryons pour la dissociation. La barre d'échelle de 500 um. B) Jemage de configuration de dissociation. Les embryons sont dans les médias et la collagénase tout en tournant jusqu'à ce que suffisamment dégagée (Protocole étape 2) C) l'image de ces deux techniques de placage de fibres musculaires;. Lamelles rondes ou plaques à 24 puits (Protocole étapes 1 et 4, respectivement) D) Un champ lumineux. image de direct dissocié les fibres musculaires de poisson zèbre plaquées sur les poly-L lysine lamelles recouvertes. Les flèches indiquent les fibres musculaires allongées de 48 HPF poisson zèbre. Barre d'échelle 30 um.

Figure 2. Immunomarquage de fibres musculaires individuelles isolées à partir de 48 embryons HPF de poisson zèbre. A) myofiber marqué avec anti-récepteur de la ryanodine (RyR1), révélant un motif en bandes le long de la fibre conforme à la localisation de la triade / appareil de couplage CE. B) myofiber marqué avec anti-α -actinine, visualizin g stries (rouge) le long de la fibre musculaire à localiser le sarcomère et mettant en évidence les bandes Z. Dans les deux images, noyaux sont marqués au DAPI, considérés comme des ovales bleus. Inserts montrent des images de grossissement de la fibre musculaire dans la grande image. A) et B) de la barre de l'échelle 30 um.

Figure 3. Représentant induite calcium réponse de libération d'un seul myofiber poisson zèbre isolé. Tous les panneaux montrent une myofiber poisson zèbre pseudocolored exprimer GCaMP3. L'évolution dans le temps présente l'augmentation de la fluorescence GCaMP3 (de couleur rouge) en réponse à l'application de caféine de 30 mM. Début de l'enregistrement avant l'application de la caféine (0 ms) et a continué de réponse de fluorescence maximale (992 ms). Barre d'échelle 30 um.nk "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Les auteurs déclarent aucun conflits d'intérêts.