$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fixation
Fixateurs sont cancérigènes, porter des gants et manipuler les fixateurs dans une hotte. Sauf indication contraire, toutes les incubations sont effectuées sur la glace et toutes les solutions doivent être filtrés avant utilisation. Utilisez la microscopie électronique réactifs de qualité.
Jour 1
- Après conditions expérimentales (par exemple, injection virale, le traitement médicamenteux), placez la membrane avec organotypiques coupes d'hippocampe dans un 60 x 15 mm boîte de Petri en polystyrène contenant glacée phosphate 0,1 M de tampon (tampon phosphate de Sorensen), pH 7,3. Ajouter 1 à 2 ml de tampon phosphate 0,1 M directement sur le dessus des tranches de les garder au froid.
ÉTAPE CRITIQUE: Utilisez toujours fraîchement préparés tampons et fixateurs. Assurez-vous que le pH du tampon est dans la plage souhaitée. A défaut de le faire pourrait endommager les structures cellulaires.
- Pour isoler le sous-champ CA1 de la tranche, utilisez unscalpel jetable en douceur couper à travers la tranche suivante à la DG, parallèlement à la couche CA1 cellule (figure 1). Ensuite, couper la tranche restante à la verticale pour enlever le sous-champ CA3 et le subiculum. Couper un coin de la tranche d'aider à identifier la surface supérieure du tissu.
REMARQUE: En cas pas de livraison virale de la protéine d'intérêt est nécessaire, la tranche de tissu ensemble peut être fixé après que les médias est enlevée avec un rinçage délicat de tampon glacé. Cette étape est suivie par découpage de la CA1.
ÉTAPE CRITIQUE: Gardez la trace de la face supérieure du tissu afin de sectionnement adéquate des grilles plus tard.
- Enlever soigneusement le tissu de la membrane à l'aide de la face arrière du scalpel. Utiliser une pipette Pasteur en douceur transférer le tissu sur une plaque à 12 puits contenant 0,1 M de tampon phosphate.
- Retirer le tampon dans le puits de la plaque et ajouter 500 m etu, L - 1 ml de fixatif glacé (pH 7,3) constituées des éléments suivants: 0,1% d'acide picrique, du paraformaldéhyde à 1%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C.
REMARQUE: L'acide picrique peut être explosif à l'état sec. Gardez-le mouillé avec de l'eau dans un récipient hermétiquement fermé. Conserver dans un endroit sec et bien aéré.
- Retirer le fixateur du puits et laver les échantillons 3 fois (20 min chacun) dans 0,1 M de tampon phosphate.
- Incuber pendant 40 min dans de l'acide tannique à 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon maléate pH 6,0.
- Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate.
- Incuber pendant 40 min dans de l'acétate d'uranyle 1% (p / v) dans du tampon maléate dans l'obscurité. L'acétate d'uranyle est sensible à la lumière et est radioactif. Couvrir le bécher avec du Parafilm lors de la dissolution et de stocker n'importe quel tampon utilisé dans l'obscurité à 4 ° C.
- Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate.
- Incuber pendant 20 min dans du chlore de platine de 0,5%IDE (p / v) dans du tampon maléate.
- Rincer deux fois (20 min chacun) dans un tampon maléate. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour un traitement ultérieur.
2. La déshydratation et la Embedding
L'oxyde de propylène est cancérigène. Éviter les vapeurs en travaillant avec lui dans une hotte. Utilisez absolue, l'éthanol pur à 100% qui ne contient aucune trace d'eau. Diluer cette éthanol absolu pour produire des concentrations différentes de déshydratation.
Jour 2
- Incuber pendant 5 min dans de l'éthanol 50% puis pendant 5 min dans de l'éthanol à 70%.
- Incuber pendant 15 min à 1% fraîchement préparée p-phénylènediamine (PPD) dans l'éthanol à 70%.
- Rincer trois fois dans de l'éthanol à 70%.
- Incuber pendant 5 min dans de l'éthanol 80% puis pendant 5 min dans de l'éthanol à 95%.
- Incuber dans l'éthanol à 100% deux fois 5 min à chaque fois.
- Préparer des flacons en verre avec bouchon à vis et assurez-vous qu'ils sont propres et sèches. Transfert tranches de flacons en verre etétiqueter chaque flacon simple et claire.
- Incuber pendant 5 min dans un mélange 1:1 éthanol: l'oxyde de propylène.
- Incuber dans l'oxyde de propylène à 100% deux fois 5 min à chaque fois.
- Ajouter de la résine (Epon) dans chaque flacon pour faire un mélange 1:1 avec de l'oxyde de propylène. Mélanger doucement pendant 2 heures. Ne pas secouer les flacons avec trop de rigueur pour éviter les bulles qui pourraient interférer avec encastrement.
- Ajouter de la résine pour faire un mélange 3:1 avec l'oxyde de propylène, et mélanger pendant 2 heures.
- Transfert à la résine 100% et incuber O / N.
Jour 3
- Échantillons en sandwich entre des bandes de plastique ACLAR et la guérison de 24 heures à 60 ° C.
3. La coupe et de montage sur les grilles
Jour 4
- Couper semi-fines (0,5 um) sections et colorer avec 1% de bleu de toluidine + 1% de borax pour déterminer l'orientation correcte des échantillons.
- Couper coupes ultrafines (60 nm) et monter sur des grilles de nickel, une section par grille.
4. Immunohistochimie
Tous les tampons et l'eau doit être filtrée avant utilisation.
Jour 5
- Déposer une goutte (~ 50 pi) de tampon Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, sur un morceau de parafilm propre sur une surface plane. Délicatement ramasser la grille avec des pinces propres par le bord et le faire flotter sur le tampon, la section vers le bas, et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Égoutter l'excès de liquide de la grille en plaçant côté de la partie sur un papier filtre puis flotter sur la glycine 50 mM dans T / PB pendant 15 min à température ambiante.
ÉTAPE CRITIQUE: Pour éviter de trop «report» de solutions d'une gouttelette de solution à l'autre au cours des incubations, les égoutter l'excès de liquide par un léger toucher le bord de la grille n ° 1 sur du papier filtre entre chaque changement de solution. Également éliminer toute solution emprisonnée entre les branches de l'EM Pince de maintien de la grille par effet de mèche doucement avec un ruban de papier-filtre entre les branches de pince tout en ENSUsonner les sections ne se dessèchent pas complètement.
- Séchez la grille avec du papier filtre, puis flotter sur une solution de blocage contenant de la BSA 2,5% et 2,5% de sérum de l'animal de l'anticorps secondaire dans T / PB pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber avec l'anticorps primaire (en T / PB) à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Le temps optimal et la température d'incubation, ainsi que la concentration d'anticorps, doivent être déterminées expérimentalement.
- Laver la grille à trois reprises (2 min chacun) avec T / PB.
- Incuber avec l'anticorps secondaire (1:20 anti-lapin ou anti-souris couplé à 10 nm d'or) pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB.
- Postfix avec le glutaraldéhyde à 2% en T / PB pendant 5 min.
- Laver trois fois (2 min chacun) avec T / PB et ensuite trois fois (2 min chacun) avec de l'eau filtrée.
- Incuber avec de l'acétate d'uranyle 2% dans de l'eau pendant 10 min.
Alors que la grille est la coloration, préparer une émission de CO 2 par chambre Placinpar pièce de Parafilm au centre d'un plat en verre de Pétri. Puis placer 4-6 pastilles de NaOH dans le plat autour du Parafilm à absorber le CO 2 dans l'air. Gardez le couvercle fermé pendant quelques minutes. Utiliser une pipette Pasteur et de transférer rapidement un petit volume de solution de citrate de plomb de Reynolds à l'Parafilm dans le plat en verre de Pétri. Ouvrez le haut juste assez pour insérer la pipette Pasteur afin de minimiser la réintroduction de CO 2 dans la chambre.
REMARQUE: Pour faire une solution de Reynolds citrate de plomb, faire bouillir 100 ml d'eau déminéralisée dans un four à micro-ondes et laisser refroidir dans un récipient hermétique. Dans un ballon volumétrique de 50 ml avec bouchon, mélange de nitrate de plomb 1,33 g, 1,76 g de citrate de sodium et 30 ml de l'eau bouillie en agitant vigoureusement pendant 1 min. Puis serrer de façon intermittente pendant 30 min. A cette solution trouble, ajouter 8 ml d'hydroxyde de sodium 1 M et lentement inverser le flacon plusieurs fois. Solution deviendra clair. Porter la solution à 50 ml avec le wa bouillieter. Conserver la solution hermétiquement fermés. Si un précipité apparaît, le jeter et en faire une nouvelle.
- Dans trois béchers petits préparer de l'eau chaude bouillante désionisée. Laver l'acétate d'uranyle par trempage de la grille dans le premier bécher et doucement tourbillonner autour pendant 30 sec. Répétez cette étape pour les deux autres béchers.
- Ouvrez la partie supérieure de la boîte de Petri en verre juste assez pour placer la grille sur la goutte de solution de Reynolds citrate de plomb. Si possible, portez un masque tout en faisant ceci pour éviter de respirer le citrate de plomb et d'empêcher la formation d'un précipité. Incuber pendant 10 min.
- Ouvrez le haut juste assez pour retirer la grille. Éviter de respirer sur le citrate de plomb. Laver la grille à trois reprises en le plongeant successivement dans trois béchers avec de l'eau chaude distillée fraîchement bouillie. Laissez sécher la grille sur un morceau de papier filtre, section vers le haut. L'échantillon est maintenant prêt pour le microscope électronique.