Revêtements de graphène pour les implants biomédicaux

Résumé

Graphène présente un potentiel en tant que matériau de revêtement pour des implants biomédicaux. Dans cette étude, nous démontrons une méthode pour les alliages de nitinol revêtement avec des couches de graphène nanométriques d'épaisseur et de déterminer comment le graphène peut influencer la réponse implant.

Résumé

Graphène atomiquement lisse comme un revêtement de surface a un potentiel pour améliorer les propriétés d'implants. Cela démontre une méthode pour les alliages de nitinol revêtement avec des couches de graphène nanométriques d'épaisseur pour les applications comme matériau de stent. Le graphène a été cultivé sur des substrats de cuivre par dépôt chimique en phase vapeur, puis transférés sur des substrats en nitinol. Afin de comprendre comment le revêtement graphène pourrait modifier la réponse biologique, la viabilité cellulaire des cellules endothéliales aortiques de rat et des cellules de rat muscle lisse aortique a été étudiée. En outre, l'effet de graphène-revêtements sur l'adhésion cellulaire et de morphologie a été étudiée avec la microscopie confocale fluorescente. Les cellules ont été colorées pour l'actine et des noyaux, et il y avait des différences notables entre les échantillons nitinol vierges par rapport aux graphène enduits échantillons. L'expression d'actine total à partir de cellules musculaires de rat lisses aortiques a été trouvé en utilisant western blot. Protéines caractéristiques d'adsorption, un indicateur de thrombogénicité potentielle, were déterminée pour le fibrinogène et l'albumine sérique par électrophorèse sur gel. En outre, le transfert de charge à partir du fibrinogène au substrat a été déduite en utilisant la spectroscopie Raman. Il a été constaté que le revêtement de graphène sur substrats nitinol satisfait aux exigences fonctionnelles pour un stent et amélioré la réponse biologique par rapport aux non couché nitinol. Ainsi, le graphène enduit de nitinol est un candidat viable pour un matériau de stent.

Introduction

Les trois dernières décennies ont vu la découverte de nouveaux matériaux à base de thérapies et dispositifs pour le traitement des maladies et des diagnostics. Les alliages nouveaux tels que le nitinol (NiTi) et en acier inoxydable sont souvent utilisés dans la fabrication implant biomédical en raison de leurs propriétés mécaniques supérieures ^1-3. Toutefois, de nombreux défis restent dus à la cytotoxicité matériel exogène, bio-et d'hémo-compatibilité. La nature métallique des alliages de ces résultats en faible bio-et hémocompatibilité en raison de la lixiviation des métaux, le manque d'adhérence cellulaire, la prolifération et la thrombose quand il entre en contact avec le sang circulant (tels que des cathéters, des greffons vasculaires, des endoprothèses vasculaires, des valves cardiaques artificielles etc.). ^{1, 4, 5} L'interaction des protéines ou des cellules vivantes avec la surface de l'implant peut conduire à une forte réponse immunitaire et la cascade de réactions biochimiques qui a suivi peut nuire à la fonctionnalité du dispositif. Par conséquent, il est Pertinent de réaliser un contrôle sur les interactions entre les implants biomédicaux et de son environnement biologique environnant. Modification de surface est souvent utilisée pour réduire ou empêcher la réponse physiologique néfaste provenant du matériau de l'implant. Un revêtement de surface idéal devrait avoir la force d'adhérence élevée, inertie chimique, lissé élevé, et bon hémo-et la biocompatibilité. Auparavant, de nombreux matériaux, y compris carbone de type diamant (DLC), le SiC, TiN, TiO ₂ et de nombreux matériaux polymères ont été testés en tant que bio-compatibles revêtements de surface d'implants. ^{1, 6-23} Cependant, ces matériaux sont toujours pas en mesure de répondre à tous les critères fonctionnels pour un revêtement de surface de l'implant approprié.

La découverte de l'atome épaisse couche de carbone sp ^2, connu sous le nom de graphène, a ouvert des portes pour le développement de nouveaux matériaux multifonctionnels. Le graphène est censé être un candidat idéal pour le revêtement de surface de l'implant, car ilest chimiquement inerte, atomiquement lisse et très durable. Dans cette lettre, nous étudions la viabilité de graphène comme un revêtement de surface pour les implants biomédicaux. Nos études montrent que le graphène nitinol recouvert (Gr-NiTi) satisfait à tous les critères fonctionnels, et prend également en charge le muscle lisse et une excellente croissance des cellules endothéliales conduisant à la prolifération cellulaire mieux. Nous constatons également que le sérum albumine adsorption sur Gr-NiTi est plus élevé que le fibrinogène. Surtout, (i) les mesures spectroscopiques détaillées confirmé l'absence de transfert de charge entre le graphène et le fibrinogène suggérant que le revêtement graphène inhibe l'activation des plaquettes par des implants, (ii) des revêtements de graphène ne présentent aucun significative de la toxicité in vitro pour endothéliales et musculaires lisses des lignées cellulaires confirmant leur biocompatibilité, et (iii) des revêtements de graphène sont chimiquement inertes, résistantes et imperméables dans un courant sanguin environnement. Ces hémo-et propriétés biocompatibles, avec st élevéerength, inertie chimique et de la durabilité, de rendre revêtements de graphène comme un revêtement de surface idéal.

Protocole

1. Graphène revêtement de NiTi

1. Les échantillons de graphène utilisés dans cette étude ont été cultivées sur cuivre (Cu) des substrats en utilisant la technique de dépôt chimique en phase vapeur, et ensuite transférés à 4,5 mm ² substrats NiTi.
2. Cu feuilles (1 cm x 1 cm) ont été placés dans un four tubulaire 1 po quartz et chauffés à 1.000 ° C en présence de 50 sccm de H ₂ et 450 sccm d'Ar.
3. Ensuite, le méthane (1 et 4 sccm) a été introduit dans le four à différents débits de 20-30 min. Les échantillons ont été finalement refroidi à la température ambiante sous un courant d'H _2, Ar et CH _4.
4. Ensuite, les feuilles de cuivre ont été déposé à la tournette de PMMA (dilué avec de l'anisole 4%) à 4.000 tours par minute suivi d'un traitement thermique pendant 5 minutes à 150 ° C. Graphène attachée à la couche de PMMA a été obtenue par gravure de la feuille de Cu en utilisant Transene Inc, CE-100 décapant, et suivie d'un rinçage à 10% de HCl et de l'eau désionisée pendant 10 min.
5. Le sexemples ont été transférées à NiTi substrats (4,5 mm ²⁾ et recuit à 450 ° C à Ar (300 sccm) et H ₂ (700 sccm) pendant 2 heures pour éliminer le PMMA. Enfin, les substrats ont été lavés avec de l'acétone pour dissoudre le PMMA résiduel pour obtenir l'échantillon Gr-NiTi. Un monochromateur de Dilor XY triple réseau a été utilisée pour la caractérisation de micro-Raman (en utilisant objectif 100X) de tous les NiTisamples GR-avec l'excitation 514,5 nm d'un laser à ions Ar ^+.

2. Toxicité in vitro des Gr-NiTi

Cellules endothéliales aortiques de rat (Cellule d'application Inc) ont été cultivées sur un enduit de gélatine glissant 8 chambres. Pour tester la croissance cellulaire, la vierge et Gr-NiTisubstrates ont été placés dans des puits sans enrobage de gélatine. Numérisation des images de microscopie électronique ont été obtenues en utilisant un Hitachi S-4800 SEM. En outre, les cellules de rat musculaires lisses aortiques ont également été cultivées dans CellBIND plaques à 96 puits en tant que groupe de contrôle (Corning) dans Dulbecco Eagle modifié Moyen (ATCC).

1. Pour tester la viabilité des cellules, les cellules (cellules musculaires lisses et endothéliales fois) ont été ensemencées à 10 ⁵ cellules / puits dans des puits contenant vierge NiTi, 1 sccm ou 4 sccm Gr-NiTi substrats, où la sccm indiqué correspond au débit de méthane utilisé dans le croissance CVD de graphène. Les cellules ont été cultivées pendant la période de temps désirée dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2, en échangeant les médias tous les jours.
2. Au point de fin, on a éliminé et du milieu frais contenant 0,5 mg / ml de bromure thiazolyle tétrazolium (MTT ou obtenus auprès de Sigma) a été ajouté à chaque puits. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 3 heures supplémentaires. Pour le dosage de MTS, on a éliminé à l'instant final et remplacé par 120 pi de solution de travail MTS (Cell niveau 96 aqueuse, Promega) et incubé pendant 3 heures.
3. Ensuite, les médias ont été éliminées en douceur et 100 ml de diméthylsulfoxyde (Sigma) a été ajouté à chaque puits. Après alloaile 10 min pour les cristaux MTT de dissolution, la solution a été transféré à une autre plaque à puits. Pour le dosage de MTS, pas de diméthylsulfoxyde a été ajouté dans les puits. Contenu des puits ont été transférés à une nouvelle plaque.
4. L'absorbance a été lue à 490 nm et la viabilité pour cent a été déterminée par la normalisation de l'absorbance à l'absorbance moyenne de l'échantillon vierge NiTi. Au moins cinq répétitions ont été effectuées pour chaque type d'échantillon.

3. Des études de microscopie confocale de la morphologie cellulaire

1. Pour l'imagerie confocale de cellules aortiques de rat musculaires lisses, les substrats ont été placés dans une diapositive 8-chambre (Thermo Scientific). Les cellules ont été ensemencées à 25000 cellules / chambre et incubées pendant 3 jours à 37 ° C et 5% de CO _2.
2. Les cellules ont été fixées sur le substrat avec du formaldéhyde 4% dans un tampon phosphate salin pendant 20 min.
3. Perméabilisées avec 0,1% de Triton-X pendant 1 min.
4. Actine a été coloré avec Alexa Fluor 488 phalloïdine (LifTechnologies e). 100 ul d'AlexaFluor 488 phalloïdine à 200 unités / ml de méthanol a été ajouté à 1,9 ml de tampon phosphate salin. Les cellules ont été colorées avec 250 pi de AlexaFluor 488 phalloïdine pendant 45 min, puis lavées deux fois avec du tampon phosphate salin.
5. Les noyaux ont été montées avec un milieu de montage Vectashield fluorescente contenant du DAPI (Vector Laboratories). Les images confocales ont été recueillies à l'aide d'un Nikon confocale TI. Une chambre ensemencé avec des cellules sans substrat a été utilisé comme témoin.

4. Protéines Les études d'adsorption

1. Dimensions du substrat ont été mesurées avec étriers avant de commencer les expériences d'adsorption des protéines. Trois mesures ont été prises pour chaque côté des échantillons carrés environ et en moyenne pour obtenir la longueur et la largeur.
2. Chaque échantillon, vierge NiTi, 1sccm et 4sccm Gr-NiTiwere incubées avec 1 mg / ml d'albumine dans un tampon phosphate salin (PBS) ou 1 mg / ml de fibrinogène dans du PBS à la salle de température pendant 3 heures.
3. Initiales à l'Identique échantillons ont été combinés dans un microtube avec 200 pi de tampon d'échantillon réducteur et on fait bouillir pendant 5 min.
4. Les échantillons ont ensuite été dilués dans un tampon Tris / Glycine / SDS (Bio-Rad) et courir à travers un gel de 4-15% Tris électrophorèse de polyacrylamide (Bio-Rad) à 90 V pendant 100 min.
5. Les gels ont ensuite été colorées avec SYPRO Rouge. Diluer la solution mère SYPRO Rouge (Life Technologies) à 1:5000 dans 7,5% d'acide v / v acétique. Colorer les gels pendant 60 min.
6. Gels d'image en utilisant un SP Flourchem (Alpha Innotech). Intensité de fluorescence a été quantifiée en utilisant le logiciel ImageJ. Intensité de fluorescence de chaque échantillon a été normalisé par la surface totale du substrat et du fibrinogène adsorption a été comparée à l'albumine par adsorption.

5. Western blot pour l'expression des protéines

1. Western blot a été réalisée afin d'analyser l'actine dans les cellules aortiques totale musculaires lisses de rat. Les cellules ont été ensemencées à 10000 cellules / substrat dans un 96-wplaque ell.
2. Les cellules ont été cultivées pendant trois jours avant de retirer médias. Protéine totale a été extrait à l'aide du tampon RIPA et un niveau BCA (Lamda) a été réalisée afin de quantifier la protéine totale.
3. Les échantillons ont été dilués à la même concentration dans RIPA et ensuite bouillie dans un tampon d'échantillon réduire pendant 5 min.
4. Les protéines ont été séparées par un gel de polyacrylamide 4-15% Tris par électrophorèse à 90 V pendant 100 min. Une protéine kaléidoscope standard (Bio-Rad) a été utilisée pour évaluer le poids moléculaire de la protéine.
5. Les protéines ont été transférées sur une membrane PVDF et bloqué avec un 1% de lait écrémé (Bio-Rad) solution sec.
6. Actine totale a été marqué avec un anticorps de lapin anti-actine rat (Sigma). Un kit de chimiluminescence BM (Roche) a été utilisée pour détecter l'anticorps primaire. Les membranes ont été imagées par FlourChem SP équipement d'imagerie et d'intensité de fluorescence a été mesurée en utilisant le logiciel ImageJ. Intensité de fluorescence a été normalisée par comparaison à la pristine NiTisample.

Résultats

. Figure 1 un graphène) CVD polycristallin Cu feuilles cultivé sur imite les grains cristallins métalliques (barre d'échelle: 10 um). b) spectre Raman de 1 sccm (4 sccm) graphène monocouche montre bande indiquant intense (relativement faible) G '(couche peu) la nature telle qu'elle est préparée de graphène. c) image AFM de graphène transférée sur NiTi présente une rugosité de ~ 5 nm. Barre d'échelle...

Discussion

Biocompatibilité et la cytotoxicité: Le dépôt chimique en phase vapeur (CVD) a donné des échantillons polycristallins de graphène qui imitaient des grains cristallins Cu, comme le montre la figure 1a. Nous avons utilisé la spectroscopie Raman pour confirmer la présence d'une monocouche (couche de quelques-uns) graphène sur 1 sccm (4 sccm) échantillons (voir figure 1b). Il est clair, 1 sccm (4 sccm) échantillons présentent bande indicative de monocouche intense (relativement...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			Réactif
Eagle modifié par Dulbecco moyen	ATCC	30-2002
Thiazolyle tétrazolium bleu	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 aqueuse un essai de prolifération cellulaire solution (MTS)	Promega	G3582
Le diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D8418
Formaldéhyde 36,5%	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
AlexaFluor 488 phalloïdine	Life Technologies	A12379
Vectashield milieu de montage avec DAPJe	Vector Laboratories	H-1200
L'albumine sérique humaine	Sigma-Aldrich	A9511
Le fibrinogène humain
Tris / Glycine / SDS	Bio-Rad	161-0732
Prêt gel Tris-HCl Gel	Bio-Rad	161-1158
L'acide acétique	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Rouge	Life Technologies	S-6653
Protéines dosage BCA bas	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus norme Kaléidoscope protéines	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot membrane de PVDF	Bio-Rad	162-0177
Buvard qualité bloqueur non gras du lait en poudre	Bio-Rad	170-6404XTU
Anti-actine anticorps produit chez le lapin	Sigma-Aldrich	A2066
Chimiluminescence BM kit Western Blot (souris / lapin)	Roche Applied Science	11520709001
Tampon RIPA	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (Ni 51%, 49% Ti)	Alfa Aesar-	44953
			Équipement
Horiba JobinYvon	Raman spectromètre	Dilor XY 98
Nikon	Microscope confocal	Eclipse TI microscope
Thermoscientific	Lecteur de plaque
Bio-Rad	Alimentation	164-5050	Alimentation électrique de base PowerPac
Bio-Rad	Cellule d'électrophorèse	165-8004	Mini-PROTEAN cellule tétra
Bio-Rad	Cassette support de gel	170-3931	Minicassette support de gel