Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l'impression par microcontact

Résumé

La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.

Résumé

Insuffisance cardiaque avancée représente un important défi clinique insatisfait, résultant de la perte d'viables et / ou entièrement fonctionnel des cellules musculaires cardiaques. Malgré un traitement médicamenteux optimal, l'insuffisance cardiaque représente une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l'identification des dosages cellulaires qui précise récapitulent normal et pathologique du myocarde physiologie humaine in vitro. De même, les défis majeurs de la biologie régénérative cardiaque tournent autour de l'identification et l'isolement des patients spécifiques progéniteurs cardiaques en quantités cliniquement pertinentes. Ces cellules doivent ensuite être assemblés en tissu fonctionnel qui ressemble à l'architecture du tissu cardiaque native impression par microcontact. Permet la création de formes précises de protéines qui ressemblent à micro-organisation structurelle du cœur, fournissant ainsi des indices géométriques pour contrôler l'adhésion cellulaire dans l'espace. Présentesnous décrivons notre approche pour l'isolement de cellules myocardiques hautement purifiée à partir de cellules souches pluripotentes de différenciation in vitro, la génération de surfaces de croissance des cellules à micro avec protéines de matrice extracellulaire, et l'ensemble des dérivés de cellules souches cellules du muscle cardiaque dans le tissu myocardique anisotrope.

Introduction

Malgré les progrès récents dans le traitement médical, l'insuffisance cardiaque avancée reste une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Le syndrome clinique résulte d'une perte de tissu myocardique fonctionnelle et par la suite une incapacité du cœur à défaut de répondre aux besoins métaboliques des personnes concernées. Puisque le cœur a une capacité limitée de régénération, la transplantation cardiaque autologue est le seul traitement actuel cliniquement acceptée directement destinées à reconstituer le tissu cardiaque perdu fonctionnelle. Inconvénients majeurs de la transplantation cardiaque, y compris un nombre limité de coeur de donneur et de la nécessité à long terme un traitement immunosuppresseur, obstacle à l'utilisation très répandue de cette thérapie. En conséquence, le traitement médical a été la pierre angulaire du traitement pour les patients souffrant de maladies cardiaques. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l'identification des dosages cellulaires qui récapitulent fidèlement la physiologie normale et pathologique du myocarde in vitro.

La récente convergence de la biologie des cellules souches et génie tissulaire technologie soulève de nouvelles avenues prometteuses pour la régénération cardiaque. Fonctionnelle génératrice tissu myocardique d'une ressource renouvelable spécifique au patient source serait une avancée majeure dans le domaine. Cela permettrait le développement de maladies spécifiques essais cellulaires pour le développement de médicaments et de découverte et jetterait les bases pour la médecine régénérative cardiaque. Homme souches embryonnaires (ES) et des cellules, de manière plus significative, l'homme souches pluripotentes induites (iPS) représentent un potentiel renouvelable spécifique au patient source de cellules souches ventriculaires et les myocytes ventriculaires adultes. La combinaison de la biologie des cellules souches et stratégies de génie tissulaire répond à ce problème en générant le tissu cardiaque fonctionnel in vitro qui peut être utilisé dans le développement de tests cellulaires pour la découverte de médicaments cardiaques ou des approches régénératives pour le traitement de l'insuffisance cardiaque avancée.

_content "> Un défi majeur dans la régénération cardiaque a été l'identification d'un type cellulaire optimale. Un large éventail de cellules ont été étudiés ^1, mais à ce jour, bien que différents précurseurs multipotentes cardiogéniques provenant de diverses sources ont été découverts, l'identification d'une cellule source qui répond aux besoins essentiels tels que l'engagement au sort cellule myogénique, le maintien de la capacité de se développer in vivo ou in vitro et la composition d'un tissu fonctionnel du myocarde s'est avéré être un problème central ^2. Nous avons déjà décrit un système de double transgénique murin qui permet l'isolement de populations hautement purifiée de progéniteurs engagés ventriculaire (PVC) à partir de cellules souches embryonnaires de différentiation in vitro. Nous avons produit une nouvelle souris double transgénique qui exprime la protéine fluorescente rouge DsRed sous le contrôle d'un amplificateur Isl1 dépendant du gène MEF2C et la protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle d'le cardio-spécifique Nkx2.5 amplificateur. Sur la base de ce système bicolore rapporteur fluorescent, premier et deuxième progéniteurs cardiaques sur le terrain du développement des cellules ES peuvent être isolés au moyen de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en fonction de leur expression de gènes MEF2C et Nkx2.5. CVP ressemblent myocytes cardiaques en fonction des profils d'expression de marqueurs myocardiques et les qualités structurelles et fonctionnelles ^3, ce qui offre de grandes promesses pour des fins de régénération des tissus cardiaques.

Bien qu'il y ait eu de nombreuses avancées dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, imitant natif architecture cellulaire reste un défi majeur. Les méthodes conventionnelles pour relever ce défi incluent ensemencement échafaudages biologiques ou synthétiques avec des cellules in vitro. En raison d'un certain nombre d'inconvénients d'échafaudages, y compris la dégradation rapide, limitée stabilité physique et mécanique et faible densité cellulaire ^1,4,5, nous avons tenté de concevoir un échafaudage moins de tissu. Altien que les cellules cardiaques peuvent modifier leur micro-environnement local par la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire, ils ont une capacité plus limitée à s'organiser pour tige en forme de myocytes cardiaques en l'absence de signaux extracellulaires. Ainsi, un modèle qui fournit les cellules appropriées repères spatiaux et biologiques pour composer fonctionnelle tissu myocardique est nécessaire. L'impression par microcontact répond à ce défi en proposant une technique simple et peu coûteux pour contrôler avec précision la forme des cellules, l'organisation et la fonction ^6-8, qui sont tous essentiels pour la production d'aligner le tissu myocardique fonctionnelle. Il comprend l'utilisation de microtexturée polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des tailles de fonction Stamps allant jusqu'à 2 microns ⁹ qui permettent le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire sur des substrats PDMS selon des schémas précis et donc d'affecter l'adhésion cellulaire spatialement.

Ici, nous proposons de combiner la technologie bio-ingénierie tissulaire avec tige cell la biologie de générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde. En conséquence, nous avons ici de démontrer notre approche récemment publiée dans les cas suivants: (1) la génération de surfaces de PDMS à micro-protéines substrats par impression par microcontact pour la génération d'un modèle aligné tissu myocardique, (2) l'isolement des progéniteurs cardiaques hautement purifiée à partir de différenciation des cellules ES in vitro, et (3) la combinaison de ces deux techniques pour générer aligné fonctionnelle du tissu myocardique.

Protocole

Le protocole de générer aligné tissu fonctionnel du myocarde peut être divisé en trois grandes parties. La fabrication du maître à micro en utilisant des techniques de lithographie douce n'est pas considéré comme faisant partie du protocole suivant, mais peut être basé sur la méthode établie ^6.

1. Impression par microcontact de la fibronectine sur PDMS Substrats

1. Mélanger Sylgard 184 (Dow Corning) en élastomère PDMS à une base de 10:1 à guérir rapport agent et dégazer l'assemblage en utilisant un dessiccateur pour éliminer les bulles d'air.
2. Durcir PDMS contre un maître précédemment fabriqué avec 20 um de large et 2 um de hauteur des crêtes séparées par un espacement 20 um pour soit 2 jours à température ambiante ou 4 heures à 65 ° C pour obtenir microtexturée timbres PDMS.

* Durcissement dans un dessiccateur est fortement recommandé d'éliminer les bulles d'air.

3. Spin couche de PDMS sur des lamelles de verre (par exemple,22x22 mm) à 5000 rpm pendant 2 min à l'aide d'une tournette Headway pour produire mince et même PDMS substrats de 15 um d'épaisseur.
4. Nettoyez timbres avec 70% d'éthanol pour enlever la poussière et les particules de saleté. Laissez-les sécher à l'air.

Timbres * peut être utilisé plusieurs fois, cependant, le renouvellement de timbres PDMS sur une base régulière est recommandée en raison d'une abrasion de la surface au fil du temps.

5. Timbres placer dans un nettoyeur de SPI Plasma Plasma II-Prep et le processus pendant 1 min à 275 mTorr à rendre les surfaces de PDMS hydrophile.

* Le traitement plasma d'oxygène doivent être surveillés. Des temps de traitement plus longs peuvent entraîner des fissures de l'élastomère.

6. Stériliser timbres avec de l'éthanol à 70% pendant 1 min. Sécher rapidement à l'air comprimé.

* D'autres mesures doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir la stérilité.

7. Couvrir les surfaces avec timbre Fsolution ibronectin (50 pg / ml dans ddH ₂ O). Laissez adsorber au moins 10 min.
8. Secouez solution de fibronectine de timbres et sèchent rapidement à l'air comprimé.
9. Établir un contact conforme entre les timbres et PDMS substrats pendant 2 minutes et appuyez fermement.
10. Rincer à micro substrats avec ddH ₂ O. Rangez-les dans ddH ₂ O pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C sauf initialement utilisé. Magasin de timbres en PDMS ddH ₂ O.

2. Entretien des doubles transgéniques lignées cellulaires embryonnaires souches

Tout d'abord, préparer les supports suivants pour la culture de cellules de souris ES:

Embryonnaires de souris fibroblastes (MEF)-Medium: Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de sérum foetal bovin (FBS) ES cellulaire ou la différenciation de classe, 1% de pénicilline-streptomycine (P / S)

Les cellules souches embryonnaires (CSE)-Medium: DMEM, 15% de FBS cellule ES de qualité,1% non-acides aminés essentiels (AANE), 0,5% P / S, 0,2% facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 0,0007% de 2-mercaptoéthanol (2-ME)

1. Manteau de plaques de 6 puits avec 0,1% stérile gélatine dans ddH ₂ O et laissez-le adsorber 15 min à 37 ° C.
2. Ajouter MEF à partir d'un aliquot décongelé à 50 ml de PBS dans un tube conique et les centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes. Resuspendre MEF MEF en moyen terme.
3. Après adsorption, aspirer l'excès de gélatine et ajouter FAE dans les puits. Laissez FAE 1 jour à fixer.

* Une aliquote de 10 millions FAE suffit pour 3 plaques de 6 puits.

4. Lorsque MEF ont attaché, ajouter des cellules ES à partir d'un aliquot décongelé à 50 ml de PBS dans un tube conique et les centrifuger à 1000 tours par minute pendant 5 minutes. Remettre les cellules ES dans l'ESC-support et les ajouter dans les puits contenant les MEF. Culture de cellules ES dans l'ESC-moyen jusqu'à ce que la confluence est atteinte.

* Une fois que les cellules ES ont atteint la confluence, repiquage est requIRED pour éviter la prolifération et de maintenir des colonies de cellules ES.

5. Préparer les cellules ES pour repiquage. Aspirer ESC-moyen et laver une fois avec du PBS stérile.
6. Aspirer le PBS et ajouter 500 ul de trypsine. Processus de 3,5 min à 37 ° C.
7. Pipeter la solution de Trypsine monter et descendre plusieurs fois pour briser les colonies de cellules ES et le neutraliser avec 500 pi de l'ESC et moyen terme.
8. Les cellules ES passage selon le rapport désiré, par exemple le transfert de 33 ul à l'autre ainsi préparée au préalable avec MEFs de passage 1/30. Maintenir les cellules ES de l'ESC-moyen.

* Un taux de passage de 1/30 permet aux cellules ES pour atteindre la confluence dans les 3 jours. Les cellules ES de passage en fonction de votre horaire de différenciation in vitro.

3. Différenciation in vitro de doubles transgéniques lignées cellulaires embryonnaires souches et d'isolement et d'ensemencement des progéniteurs cardiaques

Tout d'abord, préparer le followimédias ng requis pour la différenciation in vitro de cellules ES:

Adaptation-: Moyen Iscove modifié de Dulbecco (IMDM), 15% de FBS ES cellules de qualité, de 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% FRV, 0,0007% de 2-ME

Différenciation-Medium: IMDM, 15% de FBS différenciation de qualité. 1%, 0,5% NEAA P / S, 0,35% d'acide ascorbique 0,1 M, 0,0007% de 2-ME

1. Lancer la différenciation in vitro lorsque les cellules ES ont atteint la confluence. Manteau de 10 plats de culture stérile cm avec 0,1% de gélatine dans ddH ₂ O et laissez-le adsorber 15 min à 37 ° C.

* Soyez conscient de la durée du processus de différenciation in vitro. Il faut 8 jours jusqu'à progéniteurs cardiaques peuvent être isolés. Planifiez vos expériences en conséquence.

2. Récolte des cellules ES comme avant. Après adsorption, aspirer l'excès de gélatine et ajouter qu'environ 1/3-1/2 de la suspension de cellules ES à la culture préparésplats contenant Adaptation-support. Cellules en culture pendant 2 jours.

* Choisissez la quantité de cellules ES pour l'adaptation en fonction de vos expériences.

3. Récolte adaptée cellules ES dans un tube conique de 50 ml contenant du PBS en utilisant 1. 5 ml de trypsine. Centrifuger les cellules ES dissociées à 1000 rpm pendant 5 min et les remettre en suspension dans la différenciation et moyen terme.
4. Faire corps embryoïdes (EBS) d'environ 1.000 cellules par 10 pl à goutte 15 cm boîtes de culture à l'aide d'une pipette multicanaux. Inverser les plaques et culture suspendue EBS gouttelettes pendant 2,5 jours à 37 ° C.
5. Au bout de 2,5 jours, piscine EB de 6-8 cm 15 plats culture en un à l'aide de différenciation à moyen et à les cultiver pendant encore 3,5 jours à 37 ° C.
6. Au bout de 3,5 jours, EB recueillir dans un tube de 50 ml conique et laissez-les couler au fond pendant environ 5 min. Aspirer le surnageant et laver EB avec du PBS stérile. Laissez-EB replonger vers le bas pour approximately 5 min.
7. EB dissocier en les traitant avec 2. 5 ml de trypsine pendant 2 min dans un bain d'eau à 37 ° C en secouant le tube doucement. Ensuite, ajoutez 2. 5 ml de PBS stérile à la solution de trypsine et pipeter de haut en bas avec une pipette de 10 ml sérologique environ 8-10 fois pour briser amas de cellules. Neutraliser la trypsine avec 10 ml de tampon FACS contenant 7,5% de FBS cellules ES ou la différenciation de qualité et de 0,01% dans du PBS DAPI.
8. Centrifuger dissocié EB à 1000 rpm pendant 5 min et les remettre en suspension dans environ 1 ml de tampon FACS. Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette de 1 ml environ 8-10 fois pour briser amas de cellules.

* Ajouter tampon FACS selon le montant estimé de dissocier EB. Des cellules trop fortement concentrées peuvent obstruer pendant FACS et trop faible nombre de cellules concentrées peut prolonger le temps de FACS inutilement.

9. Transfert des cellules à un stérile à fond rond de tube avec un tamis cellulaire 35 um pour obtenirune suspension de cellules isolées.
10. Cellules ES différenciées Trier utilisant un cytomètre de flux FACSAria et obtenir purifiée populations de CVP.

* Nous avons développé une stratégie de porte multi-étapes pour isoler les cellules hautement purifiées de couleur. En bref, nous porte d'abord sur l'amplitude Forward Scatter (FSC-A) et d'amplitude Side Scatter (SSC-A) (figure 1A). Cela nous permet de séparer les cellules entières de débris cellulaires. Nous avons ensuite porte sur FSC-A et Forward Scatter-Largeur (FSC-W) (figure 1B). Cela nous permet d'isoler les cellules maillots de doublets et autres agrégats cellulaires. Nous avons ensuite porte sur SSC-A et Side Scatter-Largeur (SSC-W) (figure 1C). Cela augmente la pureté de maillots de cellules. Nous avons ensuite porte sur la coloration DAPI pour isoler des cellules viables (DAPI-négatif) à partir de cellules non viables (figure 1D). On porte ensuite sur Phycoeryhthrin amplitude (PE-A) et PE-cyanine 7 amplitude (PE-Cy7-A) afin d'obtenir vrai positif rouge (R ⁺ ) et vrais négatifs rouge (R ^- cellules) et d'exclure autofluorescentes rouge cellules négatives (figure 1E). R ⁺ et R ^- cellules sont ensuite fermée séparément sur ​​Amplitude isothiocyanate de fluorescéine (FITC-A) et PE-A pour trier vrais positifs vert (G ⁺⁾ et négatifs vrai vert (G ^-) des cellules au sein de ces populations (figure 1F + 1G). Cela se traduit par des populations de cellules 4 de la manière suivante: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ et R ^- G ^- (figure 1H).

11. Passiver à micro-substrats avec 1% de Pluronic F-127 dans ddH ₂ O pendant 10 min. Ensuite, lavez-les avec 3x PBS stérile.

* Pluronic F-127 est un agent tensio-actif qui bloque l'adhérence cellulaire. Il prend en charge le confinement de l'adhésion cellulaire à la surface à micro.

12. Fixez les joints PDMS autour de la région à motifset appuyez fermement. Puis CVP semences, sur des substrats à micro fibronectine.

Résultats

FACS-purification de cellules in vitro ES différenciées révélé quatre populations distinctes de progéniteurs (figure 1). La présence de fibronectine à micro a été confirmée par immunofluorescence qui fait preuve d'un transfert complet des lignes continues fibronectine (figure 2). Placage de FACS-isolées progéniteurs sur micropatterns fibronectine abouti à l'alignement de la R ⁺ G ⁺ et une partie de la R ^- G ⁺ populations. Bie...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons présenté une méthode pour isoler les populations purifiées de progéniteurs cardiogénique et les graines sur des substrats de fibronectine à micro ce qui leur permet d'aligner et de prendre une forme de tige myocytes cardiaques comparables. Organisation cellulaire normale est essentielle pour la fonction de tissus normaux ^8,10, en particulier pour le tissu myocardique. Les myocytes cardiaques ont été montré pour élaborer de meilleures propriétés mécaniques et ^{11,12 11,13<...}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de produit	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide L-ascorbique	Sigma-Aldrich	A4544	Préparer une solution 0,1 M dans ddH 2 O
Dessiccateur à vide de 10 pouces	Nouvelle-Tech International, Inc	55206
4 ',6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure (DAPI)	Life Technologies	D1306
Eagle modifié par Dulbecco moyen	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
Cytomètre de flux FACSAria II	BD Biosciences
Fetal Bovine SerumES-classe de cellules	Gémeaux Bioproduits	100-106
Fetal Bovine Serum différenciation de qualité	Gémeaux Bioproduits	100-500
La fibronectine de plasma bovin	Sigma-Aldrich	F4759	Solubiliser à 1 mg / ml dans ddH 2 O
Fisherfinest Prime couvercle en verre 22x22mm	Fisher Scientific	12 à 548-B
Gélatine de peau de porc	Sigma-Aldrich	G1890	Préparer une solution à 0,1% dans le trou DDH 2 O
Tournette progrès	Headway Research, Inc	PWM32-PS-CB15
Dulbecco modifié par Iscove à moyen	Thermo Scientific	SH30228.01
Facteur inhibiteur de leucémie	SoiPréparés à partir de lignées cellulaires sécrétant des FRV		Préparer la solution mère 500x
MEM non-acides aminés essentiels	Gibco	11140-050
2-mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250
Fibroblastes embryonnaires de souris	Récoltée à partir d'embryons de souris 12-15 jours
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Préparer une solution à 1% dans ddH 2 O
Tube à fond rond de 35 um tamis cellulaire	BD Biosciences	352235
SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner	Fournitures SPI	11005-AB
Sylgard184 Kit élastomère silicone	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0,25% de trypsine-EDTA	Gibco	25200-056
Vacuomètre	Fournitures SPI	11019-AB