La présence de microARN (miARN stables) dans exosomes a généré un immense intérêt comme un nouveau mode de communication intercellulaire, pour leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs et comme une voie pour l'intervention thérapeutique. Ici, nous démontrons purification d'exosomes à partir de supports de sang et de culture, suivie par PCR quantitative pour identifier les miARN transportés.
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Article de méthode
Purification et profilage de microARN des exosomes dérivés du sang et de la culture des médias
Dans cet article
Résumé
Résumé
Stable miARN sont présents dans tous les liquides corporels et certains miARN qui circulent sont protégés de la dégradation par la séquestration dans de petites vésicules appelées exosomes. Les exosomes peuvent fusionner avec la membrane de plasma entraînant le transfert de l'ARN et des protéines de la cellule cible. Leurs fonctions biologiques sont la réponse immunitaire, la présentation de l'antigène, et de la communication intracellulaire. La livraison des miARN qui peuvent réguler l'expression des gènes dans les cellules receveuses par le sang a ouvert de nouvelles avenues d'intervention cible. En plus d'offrir une stratégie pour la livraison de médicaments ou d'agents thérapeutiques ARN, contenu exosomales peuvent servir de biomarqueurs qui peuvent aider dans le diagnostic, déterminer les options de traitement et le pronostic.
Ici, nous allons décrire la procédure d'analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot pour exosmarqueurs Omal et PCR pour ARNm d'intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l'intégrité exosomal. L'ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s'assurer que nous pouvons étudier à la fois l'ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l'ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d'expression génique pour les transcriptions d'intérêt.
Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales chez les patients, les modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l'intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d'origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent variations dans miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines.
Ici, nous allons décrire la procédure d'analyse quantitative miARN et les ARN messagers (ARNm) à partir de exosomes sécrétés dans le sang et les milieux de culture de cellules. Exosomes purifiés seront caractérisés par western blot des marqueurs exosomales et PCR pour ARNm d'intérêt. microscopie électronique à transmission (MET) et immunogold étiquetage seront utilisés pour valider la morphologie et de l'intégrité exosomal. L'ARN total seront purifiés à partir de ces exosomes afin de s'assurer que nous pouvons étudier à la fois l'ARNm et miRNA partir du même échantillon. Après validation intégrité de l'ARN par Bioanalyzer, nous allons effectuer un débit quantitative PCR en temps réel moyen (qPCR) pour identifier le miARN exosomal utilisant TaqMan Array basse densité (TLDA) des cartes et des études d'expression génique pour les transcriptions d'intérêt.
Ces protocoles peuvent être utilisés pour quantifier les changements dans les miARN exosomales in patients, des modèles de rongeurs et de milieux de culture de cellules avant et après l'intervention pharmacologique. Exosomales contenu varient en raison de la source d'origine et les conditions physiologiques de cellules qui sécrètent des exosomes. Ces variations peuvent donner un aperçu sur la façon dont les cellules et les systèmes à faire face au stress ou à des perturbations physiologiques. Nos données représentatives montrent des variations dans les miARN présents dans exosomes purifiés à partir du sang de souris, le sang humain et les milieux de culture de cellules humaines
Introduction
MiARN non codantes court modulent l'expression des gènes en se liant à l'ARNm cible. Graine complémentarité de séquence de ~ 7 paires de bases permet miARN à se lier à l'ARNm cible résultant en l'inhibition de la traduction ou de diminution de la stabilité de l'ARNm, les deux pouvant entraîner une diminution de l'expression de la protéine cible 1. Recherche cours de la dernière décennie a prouvé sans équivoque un rôle fondamental pour miARN dans la médiation des fonctions cellulaires. Il ya également eu des efforts considérables dirigée vers dissection miRNA changements moléculaires qui sous-tendent les diverses maladies médiées par 2,3. En outre, l'identification récente de miARN stables dans les fluides corporels 4-6 ouvert la voie à leur utilisation en tant que nouveaux biomarqueurs qui se prêtent à un diagnostic clinique.
Un mode de transport des miARN dans les fluides corporels est via exosomes, petites vésicules qui transportent des ARNm, des protéines, des médiateurs lipidiques et microARN dans des cellules receveuses via circulant dans le sang systémiqueion 7-14. Il en résulte une modulation de l'expression des gènes dans les cellules receveuses et représente un nouveau mécanisme de communication cellulaire. Par exemple, les cellules peuvent moduler les processus immunitaires en sécrétant réglementaires et / ou exosomes absorbants contenant des biomolécules impliquées dans l'inflammation comme l'interleukine-1β (IL1β), facteur de nécrose tumorale α (TNF), facteur de croissance transformant β5 (TGFβ5), et miARN qui régulent ces gènes 13. Comme expression des miARN aberrante est une caractéristique commune à une variété de maladies humaines, ces molécules offrent de nouvelles possibilités passionnantes pour la découverte et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques 2.
MiARN circulants sont présents dans tous les liquides corporels et il est connu que la composition des exosomes est différente basée sur les cellules de base dont ils ont été libérés. Ainsi, ils offrent une avenue pour étudier l'état physiologique des cellules et comment les cellules Alter signalisation mêmets en réponse au stress, y compris les maladies. L'étude des modifications dans la composition des exosomes peuvent donner un aperçu de la transduction de signal et d'enquêter sur leur utilité potentielle en tant que biomarqueurs ou des voies d'intervention thérapeutique.
Ici, nous allons démontrer la purification d'exosomes provenant de sources multiples basés sur les protocoles publiés. Ces exosomes seront utilisés pour l'isolation d'ARN suivie par qPCR à identifier et à mesurer les niveaux de miARN présents dans les exosomes.
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Protocole
Toutes les expériences utilisant des échantillons de sang de l'homme et les rongeurs ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Les sujets humains ont été inscrits après avoir donné un consentement éclairé, tel qu'approuvé par la Drexel University College of Institutional Review Board médecine et de toutes les procédures pour les études effectuées sur des animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care Drexel et utiliser Comité.
1. Purification Exosome de sang (~ 5,5 h)
CONSEILS
- Nous remettre en suspension exosomes d'un tube de sang (~ 10 ml de sang humain et approximativement 2 ml de sang de souris) dans 300 pi de tampon de lyse ARN du kit d'isolation de miARN mirvana.
- Pour purifier exosomes de milieux de culture de cellules, les médias est filé à 500 g pendant 10 min pour éliminer les cellules et également filtrée à travers un filtre après centrifugation à 12.000 x g 0,22 um. La purification d'exosomes des milieux de culture de cellulesn'a pas besoin d'une dilution en PBS, le lavage PBS ou la seconde étape d'ultracentrifugation.
- Si les exosomes purifiés seront utilisées pour les études de protéomique, l'ajout d'une étape de centrifugation de gradient de saccharose après l'étape d'ultracentrifugation va diminuer la quantité d'agrégats de protéines et de contaminants 15.
- La morphologie observée des exosomes peuvent différer en fonction de la source et les étapes de traitement pour les TEM. Nous n'avons pas observé la morphologie en forme de coupelle pour exosomes qui a été précédemment attribuées à des différences dans le traitement de l'échantillon 9,15. Nos images TEM, y compris l'étiquetage immunogold sont similaires aux précédents rapports provenant de différentes sources, y compris le sang, biliaire et culture cortical dérivé exosomes 9,16,17.
- Inversez tube revêtu d'EDTA contenant le sang 5x et placez-les debout à la température ambiante pendant 10-60 min.
- Centrifuger à 2000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
- Recueillir la couche supérieure, le plasma, dans des tubes de 15 ml et garder sur la glace.
- Diluer fluide avec un volume égal de PBS. Centrifuger 30 min à 2000 x g à 4 ° C.
- Transfert à centrifuger les tubes, ajouter 1X PBS pour un volume total de 24 ml et centrifuger 45 min à 12000 g à 4 ° C.
- Transfert à l'ultracentrifugation tubes et centrifuger 2 heures à 110,000 xg à 4 ° C.
- Remettre le culot dans du PBS et centrifuger 1 heure à 100.000 xg à 4 ° C.
- Remettre le culot dans un tampon approprié (tampon de lyse ARN).
- Remettre en suspension dans un tampon PBS ou RIPA pour la microscopie électronique et analyse western blot, respectivement.
2. Purification d'ARN Utilisation d'un kit d'isolation miARN mirvana modification (~ 1 heure)
CONSEILS
- Préparer la zone d'isolement de l'ARN en portant des équipements de protection individuelle (EPI), essuyer les surfaces et les pipettes avec RNase Zap, et en utilisant des conseils et des tubes filtrants stériles. Bien que le protocole du fournisseur donne la possibilité de purifier seulement miRNA, nous isolons toujours ARN total, y compris l'ARNm et Mirna afin que nous puissions étudier à la fois à partir du même échantillon.
- L'ajout d'une étape de traitement à la DNase sur la colonne élimine les traces d'ADN susceptibles d'être présents. Selon la source des exosomes, l'ADN a été signalé à être absent dans exosomes purifiés à partir des sources, y compris souris et des lignées cellulaires humaines de mât 8, mais des séquences d'ADN chromosomiques ont été détectées dans les exosomes purifiés à partir du support de cardiomyocytes cultivés 18.
- Nous avons réduit le volume de solution de lavage de 1 à 350 de pi (étape 2.4 ci-dessous) parce que le vendeur fournit juste assez Laver solution 1 pour un 700 plus ul. Si le volume n'est pas qu'il n'y a pas suffisamment de solution disponible pour utiliser la totalité du contenu du kit. Les étapes suivantes ont été réalisées selon les recommandations du fabricant.
- Ajouter 1/10 volume des miRNA Additif Homogenate (30 pi) et incuber sur de la glace pendant 10 min.
- Extraire avec un volume d'acide-phénol: chloroforme égal au volume initial de lysat. Centrifuger et récupérer la phase supérieure dans un nouveau tube.
- Ajouter 1,25 volumes d'éthanol à 100% (375 pi). Vortex. Appliquer au filtre à cartouche et centrifuger 15 sec à 10.000 x g.
- Ajouter la moitié du volume de la solution de lavage des miARN recommandé 1 (350 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g.
- Ajouter 10 ul DNase 1 à 70 pi de tampon RDD (Qiagen) pour chaque échantillon. Ajouter 80 ul de colonne et incuber 15 min à température ambiante.
- Ajouter la solution de lavage 1 (350 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g.
- Ajouter la solution de lavage 2/3 (500 pi) et centrifuger 15 sec à 10.000 x g. REPEAT.
- On élue avec 40 pl 95 ° C sans nucléase H 2 O.
- Déterminer la concentration de l'ARN et diluer l'ARN à 100 ng / ul.
3. miRNA profilage des exosomes de Blood Avec Taqman Low Density Array (TLDA) Cartes (~ 6,5 h)
CONSEILS
- Préparer la zone d'isolement de l'ARN en portant PPE, essuyer les surfaces et les pipettes avec RNase Zap, et en utilisant des conseils et des tubes filtrants stériles.
- Étape de pré-amplification (préampli) est recommandé pour 1-350 ng ARN (350-1,000 échantillons ng ne nécessitent pas l'étape de pré-ampli après synthèse de l'ADNc). Il est important de déterminer si les pré-ampli est nécessaire pour votre échantillon parce que vous devez traiter tous les échantillons dans des conditions égales. Étape de pré-ampli ajoute le coût et les valeurs de Ct avoir un hors coupe acceptable inférieure (32 au lieu de 40).
- Il est utile de préparer la réaction d'ADNc dans des tubes de la bande au lieu d'une plaque en fonction du nombre de cartes qui peuvent être exécutés en une seule journée. Cela permettrait de minimiser gel-dégel des échantillons d'ADNc qui ne seront pas traitées le jour même.
- Les exosomes provenant de différentes sources ont diffélouer quantités d'ARN. Ce protocole permet à un maximum de 3 pi matrice d'ARN pour la réaction de synthèse de l'ADNc. Selon la source, la quantité d'ARN exosomales qui peut être isolé peut-être limitée. Alors un tissu typique donnerait suffisamment d'ADNc d'ARN qui serait faite à partir de 100 ng d'ARN dans le volume 3 pl, exosomes à partir de sang humain ou de milieux de culture de cellules humaines contiennent souvent moins d'ARN et d'ADNc doit être faite à partir de moins de matériau de départ. Souris exosomes de sang contiennent des niveaux élevés d'ARN et d'au moins 100 ng à 3 pi peuvent être obtenues.
- Pour préparer l'ADNc à partir d'ARN utilisant des pools Megaplex purifiée inverser amorces transcriptase (groupe A et groupe B contient des amorces pour les miARN sur les cartes microfluidiques module A et B), dégeler les composants de la réaction sur la glace.
- Étiquette deux RNase tubes de 1,5 ml pour la réaction RT avec piscine A amorces ou des amorces du groupe B et ajouter des composants afin de graphique. Ajoutez au moins un volume supplémentaire de composants pour 2 ou plusieurs réactions ou faire un mélange maître selon les recommandations duIl vendeur.
| Composant de réaction RT | Concentration des composants | Volume 1 pour l'échantillon (total V / échantillon = 4,5 pi) |
| Eau sans nucléase | 0,20 pi | |
| RT tampon Megaplex (10X) | 1X | 0,80 pi |
| dNTP (100 mm) | 4,4 mM | 0,20 pi |
| MgCl2 (25 mM) | 5 mM | 0,90 pi |
| RNase Inhibitor (20U/μl) | 2 U | 0,10 pi |
| Megaplex RT amorces A ou B (10X) | 1X | 0,80 pi |
| MultiScribe transcriptase inverse | 75 U | 1.50 pi |
- Inverser tubes 6 fois et centrifuge brièvement. Ensuite, pipette 4,5 ul de mélange réactionnel RT dans MicroAmp des bandes de 8 tubes ou une plaque de réaction optique 96 puits MicroAmp.
- Ajouter 100 ng d'ARN et d'ajuster le volume à 3 pi avec de l'eau traitée au DEPC ou ajouter 3 ARN total ul, mélanger avec la pointe de la pipette, et sceller les tubes ou la plaque. Centrifuger brièvement et incuber sur de la glace pendant 5 min.
- Chargez la réaction dans la machine PCR et l'exécuter dans les conditions suivantes (tel que recommandé par le Biosystems protocole de Piscines Megaplex Appliquées):
| Étape | Temp | Heure |
| Cycle (40x) | 16 ° C | 2 min |
| 42 ° C | 1 min | |
| 50 ° C | 1 s | |
| Tenez | 85 ° C | 5 min |
| Tenez | 4 ° C | ∞ |
- Stocker l'ADNc à -20 ° C (bon pour au moins une semaine) ou passez à l'étape pré-ampli qui peut être stocké pendant une semaine.
- Décongeler les amorces de préampli pour la poule A et poule B sur la glace et mélanger par inversion. Swirl Taqman pré-ampli maître mélanger et garder sur la glace aussi.
- Suivre le tableau en ajoutant au moins un volume supplémentaire de composants pour 2 ou plusieurs réactions ou faire un mélange maître tel que recommandé par le vendeur.
| Composant de réaction pré-ampli | Volume de 1 échantillon |
| Eau sans nucléase | 7,5 pl |
| Taqman PreAmp Master Mix (2X) | 12,5 pi |
| Primaires PreAmp Megaplex A ou B (10X) | 2,5 pl |
- Pipette 2,5 pi RT product dans MicroAmp barrettes de 8 tube ou une plaque de réaction optique 96 puits MicroAmp et distribuer 22,5 ul mélange réactionnel PreAmp dans chaque puits.
- Sceller la plaque, incuber sur de la glace 5 min, puis charger l'échantillon dans la machine PCR. Exécuter dans les conditions suivantes.
| Étape | Temp | Heure |
| Tenez | 95 ° C | 10 min |
| Tenez | 55 ° C | 2 min |
| Tenez | 72 ° C | 2 min |
| Cycle (12x) | 95 ° C | 15 sec |
| 60 ° C | 4 min | |
| Tenez | 99,9 ° C | 10 min |
| Tenez | 4 ° C | ∞ |
- Après la réaction préampli est terminée, centrifuger brièvement les tubes ou la plaque, puis ajouter 75 pl 0,1 X TE pH 8,0 à chaque bien ou d'un tube.
- Scellez et mélanger et centrifuger brièvement. Conserver le produit dilué pendant une semaine à -20 ° C ou continuer à charger la plaque.
- Combinez les éléments suivants dans un tube RNase 1,5 ml sur la glace.
| Composant | Volume pour 1 carte |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) | 450 ul |
| Préampli produit dilué | 9 pl |
| Eau sans nucléase | 441 ul |
- Inverser le tube pour mélanger et centrifuger brièvement. Distribuer 100 ul mélange de réaction PCR dans chaque port de la carte Array MicroRNA Taqman.
- Centrifuger la carte 2 x 1000 g pendant 1 min. Sceller la carte et l'exécuter en utilisant le modèle fourni avec les amorces dans le manuel Applied Biosystems et les réglages faibles ainsi Array Densité Taqman 384. Nous utilisons système Applied Biosystems 7900HT rapide PCR en temps réel.
4. ARNm Analyse par TaqMan (~ 1,5 h)
- Pour préparer réaction qPCR, mélanger les composants de la réaction dans l'ordre du tableau. Tous les échantillons seront analysés avec des sondes d'amorces pour le gène d'intérêt ainsi que l'ARNr 18S comme gène normalisateur.
| Composant de réaction Taqman | Volume de 1 échantillon |
| Eau sans nucléase | 7 pl (ajuster basé sur échantillons individuels) |
| Taqman rapide Master Mix (2X) | 10 pl |
| Sondes d'amorces TaqMan (20x) | 1 pl |
| ADNc à partir de 100 ng d'ARN | 2 & mu, L (ajuster basé sur échantillons individuels) |
- Exécutez la plaque de 96 puits en utilisant le bloc 96 puits rapide tel que recommandé par le fabricant (Applied système de PCR en temps réel Applied Biosystems 7900HT rapide).
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Résultats
Après avoir isolé les exosomes de milieux de culture du sang ou des cellules, la pureté des exosomes peut être testée par microscopie électronique (EM) et Western blot (Figures 1A et 1B). Nous avons confirmé nos préparations d'exosomes provenant de diverses sources avec EM et western blot en utilisant des anticorps multiples. Figure 1A montre EM images confirment que les exosomes sont intactes avec un diamètre d'environ 30 nm -100 et contiennent CD81 par un marq...
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Discussion
Dans ce protocole, nous montrons la quantification des miARN et ARNm des exosomes purifiés par centrifugation différentielle de médias de sang et de culture. Les exosomes sont diverses composantes dépend de leur origine et sont impliqués dans un certain nombre de fonctions biologiques, y compris la réponse immunitaire, la présentation de l'antigène, la communication intracellulaire, et le transfert de l'ARN et des protéines 9,11,12,19,20. Bien que la taille et la forme est un facteur déterminant de la...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Cette étude a été financée par des fonds de Rita Allen subvention de la Fondation à Seena Ajit. Les auteurs tiennent à remercier Erika Balogh et le Dr Soumitra Ghoshroy de l'Université de Caroline du Sud Electron Microscopy Center pour l'utilisation de l'instrument, une assistance scientifique et technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Vacutainer à revêtement EDTA (tubes de 10 ml) | BD Diagnostics | 366643 | Pour la purification d’exosomes à partir de sang humain |
| Vaporicaine à revêtement EDTA (tubes de 2 ml) | BD Diagnostics | 367841 | Pour la purification d’exosomes à partir de sang de souris |
| PAXgene Tube d’ARN | BD Diagnostics | 762165 | Pour l’isolement de miARN à partir de sang total |
| Kit d’isolement de microARN miRVana | Ambion | AM1561 | |
| Acide-phénol : CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | Pour cartes TLDA |
| Megaplex RT rongeurs Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex preamp rongeurs Pool set v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Taqman Array Rongeurs MicroARN A+B set V3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT Piscine Humaine Set V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp Human Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array MicroARN Humain A+B Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman Kit MicroARN RT | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR | master mix Applied Biosystems | 4366072 | Pour ARNm qRT-PCR |
| Facteur de nécrose tumorale (sonde d’amorce) | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (sonde d’amorce) | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima First Strand ADNc Kit de synthèse pour RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | Pour l’anticorps ARNm |
| HSP70 | Abcam | ab94368 | Pour western blot |
| Anti-lapin IgG-Gold | Sigma | G7402 | Pour la microscopie électronique |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| Nickel 300 mesh carbon formvar grids | Sciences Microscopie électronique | Sciences FCF300-Ni | |
| Cuivre 300 mesh carbone formvar grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| Table 1. Tableau des réactifs spécifiques. |
Références
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Réimpressions et autorisations
