Article de méthode

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

DOI :

10.3791/50323

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23 juin 2013

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1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

Dans cet article

Résumé

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L'article décrit une adaptation facile facile In vitro Modèle pour étudier la polarisation des macrophages. En présence de GM-CSF/M-CSF, les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse sont dirigés dans la différenciation monocytaire, suivie par la stimulation M1 ou M2. L'état d'activation peut être suivi par des changements dans les antigènes de surface cellulaire, l'expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'article décrit une adaptation facile facile modèle in vitro pour étudier la polarisation des macrophages. En présence de GM-CSF/M-CSF, les cellules souches / progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse sont dirigés dans la différenciation monocytaire, suivie par la stimulation M1 ou M2. L'état d'activation peut être suivi par des changements dans les antigènes de surface cellulaire, l'expression des gènes et les voies de signalisation cellulaire.

Introduction

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Distinct de réponses inflammatoires classiques, les macrophages qui infiltrent les tissus manifestant souvent état ​​d'activation polarisée qui joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions physiologiques des tissus de l'hôte 1-8. Lors de la stimulation, l'activation des macrophages peut être triée en classique (M1) et alternative (M2) activation 2, 4, 9. L'activation des macrophages M1 dépend de récepteurs Toll-like (TLR) et l'activation du facteur nucléaire kappa B (NFkB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), conduisant à la production de cytokines inflammatoires, comme le TNF-α et d'IL- 1β et de l'activation de la iNOS qui résulte en une production accrue d'espèces réactives de l'oxygène, comme l'oxyde de nitrure (N) 10, 11. En revanche, M2 recrues d'activation des macrophages PPARy, PPARÔ, ou l'IL-4 STAT6 voies, conduisant à l'activation alternatif, anti-inflammatoire (M2) qui est associée à la régulation positive des récepteurs mannose CD206, et arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

moelle macrophages dérivés d'os (BMDM) présentent un idéal modèle in vitro de comprendre les mécanismes qui contrôlent la polarisation des macrophages activés 15. Plus précisément, l'activation des macrophages M1 peut être induite par les lipopolysaccharides (LPS) stimulation, tandis que la polarisation des macrophages M2 peut être induite par l'IL-4 et / ou de l'IL-13. Moelle osseuse macrophages dérivés matures et les macrophages activés peuvent être identifiés grâce à l'analyse de cytométrie en flux pour l'expression des antigènes de surface, y compris CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 et CD86 9, 16, 17. En outre, des changements dans la production de cytokines et les voies de signalisation cellulaires associés à la polarisation des macrophages peuvent être mesurés par RT-PCR quantitative et Western blot, respectivement. En résumé, la moelle osseuse macrophages dérivés de souris peuvent servir de modèle pertinent pour étudier la polarisation des macrophages in vitro.

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Protocole

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1. Isolement de cellules de moelle osseuse

  1. Isoler fémur et du tibia os 6-8 semaines vieilles souris, rincer les cheveux et découpées ensuite l'os.
  2. Utiliser une aiguille 21G et 10 ml seringue pour débusquer osseuse dans PBS froid +2% inactivé par la chaleur du sérum de veau fœtal (FBS) (3-5 ml / souris).
  3. Passez osseuse à travers une aiguille 21G 4-6 fois de dissocier les cellules.
  4. Passez cellules à travers un tamis cellulaire um 70 pour enlever des amas de cellules, des os, des cheveux et d'autres cellules / tissus.
  5. Ajouter 3 volumes de solution de NH 4 Cl (0,8% solution de NH 4 Cl, Stemcell Technologie), et incuber sur de la glace pendant 10 min pour éliminer les globules rouges.
  6. Isoler les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
  7. Reprendre le culot cellulaire dans du PBS froid +2% FBS (20-50 ml, en fonction de la quantité de cellules).

2. Formation BMDM à induction

  1. Remettre en suspension les cellules de moelle osseuse isolées dans un milieu de croissance BMDM (2x10 6 cellules / ml).

Un milieu de croissance BMDM:

Le milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM) + 10% de FBS + 15% filtré (0,2 um) L-929 cellules (ATCC, CCL-1) surnageant de culture (contenant des monocytes-colony stimulating factor, M-CSF) ou 10 ng / ml M -CSF.

Note: L-929 surnageant cellulaire contient M-CSF 18. Pour assurer l'activité effective de milieu conditionné, 5 X 10 5 L-929 cellules sont ensemencées dans des flacons T75 cm 2 pour 6-7 jours, le milieu conditionné est recueilli et passé à travers un filtre de 0,45 um avant utilisation. Portions moyennes peuvent être utilisées immédiatement ou stockées dans des -80 ° C pendant 1-2 mois.

  1. cellules de semences dans 6 ou 12 plaques de culture de tissus ainsi (selon le modèle expérimental) (Corning Costar).
  2. Changer le milieu de croissance BMDM frais le jour 3.
  3. Au jour 7, la formation de BMDM mature est évaluée par une analyse de cytométrie en fluxet fluorophore anticorps conjugués pour détecter les cellules exprimant CD11b et F4/80.

3. BMDM Activation polarisé

  1. Au jour 7, changer de milieu de stimulation douce: pour l'activation M1, utilisez IMDM contenant 10% de FBS et 100 ng / ml de LPS ou 100 ng / ml de LPS avec 50 ng / ml IFN, par activation M2, utilisez IMDM contenant 10% de FBS avec 10 ng / ml d'IL-4 et / ou de 10 ng / ml d'IL-13.
  2. Recueillir BMDMs stimulées par les détachant du plat chaud en utilisant trypsine à 0,05%, suivi par le lavage des cellules deux fois avec du PBS contenant 10% de FBS.

Remarque: Pour retirer et remettre les macrophages matures après différenciation, solution de trypsine à 0,05% (contenant 0,48 mM EDTA, Invitrogen) ou 2-5 mM EDTA de Ca et Mg-PBS sans tampon ou équilibrée de Hank (HBSS) peut être utilisé. Lors de l'utilisation moyenne digestif contenant de la trypsine, les cellules sont traitées à 37 ° C pendant moins de 10 minutes pour éviter la perte de survisage protéines de due à une sur-digestion.

  1. Utiliser des anticorps pour détecter l'expression des antigènes de surface des cellules, y compris CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ou CD86 à différents points dans le temps en utilisant des procédures de coloration de cytométrie de flux standard.
  2. Déterminer l'expression de gènes caractéristiques de macrophages activés M1 et M2 dont l'IL-1β, TNF-α et d'IL-6 (activation M1) ou de l'IL-10, IL-13, arginase1 et PPAR (activation M2) à l'aide qRT-PCR. Déterminer l'activation des voies de signalisation cellulaires impliqués dans l'activation des macrophages M1 ou M2 par analyse western blot.

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Résultats

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Une description schématique de la procédure de génération BMDM est présentée (figure 1). Haute pureté des macrophages matures peut être observée le jour 7 quand ils représentent 95 à 99% de CD11b + + cellules F4/80 (Figure 2). Macrophages polarisés peuvent être examinés en utilisant des anticorps contre CD11b, F4/80, CD11c et CD206 suivie d'une analyse de cytométrie en flux. Comme le montre la figure 3, les macrophages M1 sont détectés comme CD11b + F4/80 + CD11c + CD20...

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Discussion

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Nous rapportons ici une procédure simple et facilement adaptable in vitro pour induire l'activation des macrophages dérivés de cellules progénitrices de la moelle osseuse. Cette procédure peut être utilisée pour l'étude des mécanismes responsables de la polarisation des macrophages. La pureté des macrophages matures obtenus en utilisant ce protocole moyennes de 95 à 99%, et aucune procédure de purification supplémentaires sont nécessaires. Pour étudier la fonction des gènes spécifiques d'intérêt dan...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association (BGIA 7850037 pour Dr. Beiyan Zhou).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Sérum fœtal bovinInvitrogen10438-026
Murin GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 &mu ; Filtre à cellules mBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-souris CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-souris F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-souris CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-souris CD86-PEeBioscience12-0862-81
Propidium IodineInvitrogenP3566

Références

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  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
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Mots-clés

Cytom trie en fluxPCR en temps r elWestern BlotAntig nes de surface cellulaireAnalyse de l expression g niqueActivation M1 M2D tection des cytokinesVoies de signalisation cellulaire

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