Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Résumé

Macrophages dérivés de monocytes sont des cellules importantes du système immunitaire inné. Ici, nous décrivons un outil facile à utiliser In vitro Modèle pour générer ces cellules. Utilisation de la centrifugation en gradient, l'isolement bourrelet négative et des conditions de culture de cellules spécifiques, des macrophages dérivés des monocytes peuvent être générés pour les études phénotypiques et fonctionnelles.

Résumé

Macrophages dérivés de monocytes représentent un type de cellules importantes du système immunitaire inné. Des modèles murins qui étudient la biologie des macrophages souffrent des différences phénotypiques et fonctionnels entre les macrophages dérivés de monocytes murins et humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle in vitro pour générer et étudier les macrophages humains primaires. En bref, après une centrifugation en gradient de densité du sang périphérique prélevé dans une veine de l'avant-bras, les monocytes sont isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique en utilisant négative isolement bille magnétique. Ces monocytes sont ensuite cultivées pendant six jours dans des conditions propres à induire différents types de différenciation des macrophages ou de polarisation. Le modèle est facile à utiliser et évite les problèmes causés par les différences spécifiques entre la souris et l'homme. En outre, il est plus proche de la conditions in vivo que l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées. En conclusion, le modèle décrit ici est adapté pour étudier macrophage biologie, identifier les mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles thérapeutiques. Même s'il n'est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l'identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

Introduction

Macrophages dérivés de monocytes représentent un composant cellulaire importante du système immunitaire inné et de contribuer à de nombreux processus inflammatoires aigus ou chroniques ^1. Les macrophages jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires comme l'athérosclérose ou le cancer ^2. Macrophages montrent un haut degré de plasticité et sont en mesure d'assumer des phénotypes différents en fonction de la micromilieu locale ^3. Ainsi, l'étude de la différenciation des macrophages et l'hétérogénéité est essentielle pour accroître notre connaissance de la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouvelles thérapies.

Dans de nombreux cas, les modèles murins sont utilisées pour étudier la physiopathologie des maladies spécifiques. Cependant, des études de biologie des macrophages en utilisant des modèles de souris est accompagné de plusieurs lacunes: (1) la proportion de numéros de sous-ensembles de leucocytes (c.-à-monocytes et granulocytes) dans peripheral sang de souris ou l'homme diffère de manière significative suggérant différents rôles des monocytes dans la physiopathologie murin et humain. (2) Il existe des différences considérables dans l'expression des gènes entre les monocytes du sang périphérique humain et murin suggérant des différences substantielles dans leur fonction pendant la santé et la maladie ^4. (3) Un certain nombre de marqueurs qui sont utilisés pour identifier les monocytes et les macrophages (F4/80, Lyc, etc.) Murines n'existe pas dans les cellules myéloïdes humaines, ce qui rend le transfert des résultats dans des modèles murins de la situation humaine difficile.

Ainsi, afin d'accroître notre compréhension de la différenciation des macrophages et l'hétérogénéité dans les maladies humaines, nous avons besoin de faire usage de modèles de travail avec les macrophages humains. Par conséquent, nous décrivons ici un modèle de production de macrophages primaires humain qui est facile à utiliser et permet d'étudier les macrophages dérivés de monocytes humains in vitro dans des conditions différentes résultant en différents macrophage potypes de risation. Dans plusieurs études, nous avons utilisé le modèle in vitro de dérivés de monocytes macrophages humains primaires pour analyser la biologie des macrophages et son intérêt potentiel pour l'athérosclérose humaine ^5-7.

Même s'il n'est pas entièrement remplacer les expérimentations animales ou tissus humains obtenus post mortem, le modèle décrit ici permet l'identification et la validation des mécanismes de la maladie et de cibles thérapeutiques qui peuvent être très pertinents pour diverses maladies humaines.

Protocole

1. Protocole

1. Préparation des tampons comme suit:
   1. Préparer tampon pour l'isolation des PBMC: «Lavez-tampon" = 0,02% d'EDTA dans du PBS (utilisation d'EDTA 0,5 M).
   2. Préparer tampon pour l'isolement des monocytes: "tampon de rinçage MACS" = 0,5% de BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 pi) + PBS (50 ml). Degas la mémoire tampon.
   3. Préparer tampon pour FACS coloration et le stockage des cellules: «tampon FACS" = 10% FCS dans du PBS et «tampon de fixation" = 1% PFA dans du PBS.
2. Dessinez 30 ml de sang dans une veine de l'avant-bras. Utilisation de l'EDTA comme anticoagulant.
3. Isoler CMSP (histopaque) comme suit:
   1. Préparer deux tubes de 50 ml stériles (pas de poly-styrène).
   2. Diluer le sang à partir de l'étape 2 avec PBS 1:1.
   3. Ajouter 25 ml + 25 ml histopaque de sang total / PBS par tube. Assurez-vous que histopaque et le sang ne se mélangent pas.
   4. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante, pas de frein.
   5. Aspirer plasma et le jeter.
   6. Aspirer l'interface opaque et pipette en propre de 50 ml baine.
   7. Ajouter 20 ml d'EDTA 0,02% en PBS.
   8. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C.
   9. Rejeter le surnageant.
   10. Ajouter 10 ml d'EDTA 0,02% en PBS.
4. Compter les cellules comme suit:
   1. Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes.
   2. Prenez 200 pi suspension cellulaire + 300 pl EDTA 0,02% en PBS + 500 pi de bleu Trypan (200-500 cellules/10 places, sinon changer le facteur de dilution).
5. Effectuer isolement négatif de monocytes comme suit:
   1. Centrifuger les cellules obtenues à l'étape 3.10 pour 10 min, 120 x g. Rejeter le surnageant.
   2. Laver le culot cellulaire 2x en ajoutant 10 ml de PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g.
   3. Ajouter 9 ml d'eau stérile pendant 3 secondes, ajouter 1 ml PBS 10X.
   4. Laver une fois de plus avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger 10 min, 120 x g.
   5. Comptez pendant la centrifugation.
   6. Diluer dans le tampon EasySep à 5 x 10 ⁷ / ml.
   7. Ajouter 50 pl / ml robinet d'enrichissement monocytesqueue.
   8. Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
   9. Perles Vortex pendant 30 sec.
   10. Ajouter 50 perles pl / ml.
   11. Incuber pendant 5 min à 4 ° C.
   12. Remplir avec un tampon EasySep à compléter volume de 2,5 ml. La solution semble maintenant brunâtre.
   13. Mettre en aimant.
   14. Attendez 2,5 min à température ambiante. Pendant ce temps, les cellules monocytaires non liés à la bille magnétique se déplaceront sur la paroi du tube et y coller.
   15. Verser tampon avec des monocytes non contraignants dans le tube stérile frais. Cette solution est blanchâtre.
   16. Laver une fois avec PBS + 0,02% EDTA et centrifuger pendant 10 min, 120 x g.
6. Cellules de la plaque dans un récipient de plastique ou d'une plaque multi-parois à une densité de 0,5 x 10 ⁶ / cm ^2. Ajouter 1 ml de milieu de culture / 1 x 10 ⁶ cellules.
7. cellules de culture dans des conditions d'intérêt pour les 6-14 jours.
8. Changer médias après 3 jours en remplaçant 50% des médias avec les médias frais (voir le tableau 1 pour plus de détails).
9. Après six jours Récolte des cellules pour l'isolement de l'ARNm, la cytométrie en flux, Western blot, etc.

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, on obtient systématiquement 25,1 x 10 ⁶ ± 2,2 x 10 ⁶ monocytes/100 ml de sang (moyenne ± écart-type de 26 expériences indépendantes, figure 1A). La pureté des monocytes, tel que déterminé par coloration de cytométrie en flux pour CD14 est systématiquement supérieure à 95% (97,1 ± 0,4%, moyenne ± écart-type de 3 expériences indépendantes, figure 1B). La viabilité cellulaire de monocytes fraîchement isolés, tel que détermin...

Discussion

Les macrophages dérivés des monocytes représentent le type de cellule clé du système immunitaire innée. Ils jouent un rôle important dans de nombreuses maladies inflammatoires, y compris l'athérosclérose ou le cancer ^2. Ainsi, l'étude de la biologie des macrophages est essentielle pour accroître nos connaissances sur la physiopathologie de nombreuses maladies et de permettre le développement de nouvelles thérapies.

De nombreuses études s'appliquent des souris surexprim...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger de 50 ml (stérile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquide (sans calcium ni magnésium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Kit d’enrichissement de monocytes humains	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Tubes FACS	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Pénicilline-streptomycine	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
humain M-CSF 10 &mu ; g	Peprotech	300-25
Plaques de culture cellulaire 6 puits	Fisher	07-200-80