Identification de Motifs Fonctionnelles et leurs PARTENAIRES DE LIAISON Peptide-basée sur

Résumé

Techniques pour disséquer les mécanismes qui sous-tendent la sécrétion de HIV-1 Nef dans exosomes sont décrits. Peptides courts spécifiques provenant de Nef et la transfection de protéines ont été exploités pour déterminer la structure, la fonction et les partenaires de liaison de la sécrétion Modification de la région de Nef. Ces procédures présentent un intérêt général dans de nombreuses études mécanistes.

Résumé

Peptides courts spécifiques sont dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, dans notre cas le VIH-1 Nef, non seulement conservent leur fonction biologique, mais peuvent également inhiber de manière compétitive le fonction de la protéine full-length. Un ensemble de 20 Nef peptides de numérisation, 20 acides aminés dans longueur les uns avec les qui se chevauchent 10 acides aminés de son voisin, ont été utilisés pour identifier des motifs dans Nef responsable pour son induction de l'apoptose. Peptides contenant des ces motifs apoptotiques induites l'apoptose à des niveaux comparables à la protéine de Nef full-length. A second peptide, dérivé à partir de la région de la Modification de Sécrétion (SMR) de Nef, a conservé le capacité à interagir avec des protéines cellulaires impliqués dans la sécrétion de Nef dans exosomes (exNef). Ce peptide SMRwt a été utilisé comme la protéine "d'appât" dans des expériences de co-immunoprécipitation pour isoler les protéines cellulaires qui se lient spécifiquement au motif de la SMR de Nef. Protein transfection et de l'anticorps inhibition a été utilisé pour perturber physiquement le pari de interactionween Nef et mortaline, l'un des les protéines SMR-de liaison isolés, et l'effet a été mesurée avec un dosage de sécrétion exNef fluorescent-basée sur. La capacité de la SMRwt peptide à outcompete Nef full-length pour des protéines cellulaires qui se lient le motif de SMR, assurez-il le premier inhibiteur de la sécrétion exNef. Ainsi, par employant les techniques décrites ici, qui utilisent la les propriétés uniques de peptides courts spécifiques dérivés à partir de motifs trouvés dans les protéines full-longueur, on peut accélérer l'identification de motifs fonctionnels dans les protéines et le développement d'inhibiteurs de fonctions de pathogènes peptide-basés sur.

Introduction

Avec l'avènement de thérapie anti-rétrovirale, l'épidémie de SIDA dans le monde occidental a été ralentie, mais pas écourtée, et la propagation du VIH continue d'être un majeur fardeau de santé tout au long de le monde. Avec l'exception de le procès marginalement efficaces l'essai RV144 Thai, vaccins contre le VIH ont jusqu'ici montré échec pour protéger à partir de infection. Ainsi, la recherche en cibles thérapeutiques supplémentaires, potentiels est encore justifié.

Le long de avec CD4 l'épuisement T-cellule, l'activation immunitaire généralisée persistante est un marque de fabrique de infection à VIH. C....

Protocole

I. Utilisez du film de court Peptides dans Analyse Biological

I.1. Mappage des Motifs biologiquement fonctionnel en utilisant des peptides

1. Le traitement des cellules avec peptides de numérisation Nef
   1. Appel fait un ensemble de peptides de balayage la région d'intérêt. Pour nos expériences, des peptides 20mer, avec 10 chevauchement d'acides aminés, enjambant l'ensemble du-1 le VIH protéine Nef (205 aa), ont été obtenus à partir de le Reagent Program SIDA. Les peptides sont été dosés individuellement en tant que suit:
   2. Les Ajouter 10 ng / ml de peptide à le milieu de culture de cellule.
   3. Ajouter....

Résultats

Cartographie Motifs biologiquement fonctionnels en utilisant des peptides. Deux régions ont été identifiées sur les protéines Nef qui induisent l'apoptose. Apoptose peptide-driven a été observée (Figure 2) en commençant par peptide N50 (aa30-50), avec un pic à N60 (AA40-60) et N70 (AA50-70), et en diminuant les niveaux de fond au peptide N100 (AA80-100). La majeure Motif 1 (M1) de pointe, centrée sur AA50-60, induit> 80% des niveaux apoptotiques de la protéine Nef pleine longueur. Un.......

Discussion

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent la capacité de Nef pour manipuler la voie de la traite des êtres exosomal sera utile dans nouveaux inhibiteurs d'ingénierie de la sécrétion exNef. L'inhibition de la sécrétion exNef devrait diminuer l'épuisement des cellules T CD4 et de la CIA qui pathogenèse dur VIH / SIDA. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé un certain nombre de nouveaux réactifs et de méthodes qui nous ont permis d'analyser la génétique de la sécrétion exNef, et commencer à déte.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ensemble de peptides 20mères avec chevauchement de 10 acides aminés	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Tecan GENEios fluorimeter	(Tecan Group, Switzerland)
Plaque de microtitration noire à 96 puits	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G perles magnétiques	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (deux positions)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	Résine C18 (0,6 &mu ; l ou 0,2 &mu ; l volumes de lit). Les oligonucléotides ou petits (< 50 kDa) protéines/peptides en solution aqueuse
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF