Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

Résumé

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de Arabidopsis thaliana Graines. Embryons jusqu'à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l'ADN, l'expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage In situ Analyses d'hybridation.

Résumé

Chez les plantes à fleurs, l'embryon se développe au sein d'un tissu nourricier - l'endosperme - entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l'isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d'Arabidopsis et l'adhérence de l'embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'isolement efficace des jeunes embryons d'Arabidopsis, produisant jusqu'à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d'isolement d'un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l'intermédiaire d'un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d'un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d'applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l'ARN, des analyses de méthylation de l'ADN, l'hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.

Introduction

L'embryon de plantes à fleurs est entouré par l'albumen, un tissu nutritif dérivé d'un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l'endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l'enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l'intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d'embryons d'Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au ....

Protocole

La procédure est résumée dans l'organigramme de la figure 1. Le microcapillaires et la configuration instrumentale sont présentés dans la figure 2 et la figure 3, et les étapes typiques de l'isolement de l'embryon sont présentés dans la figure 4.

1. Matière et mémoire tampon Préparation

1.1 Silicon revêtement de verre microcapillaires

1. Placez le microcapillaires dans un tube Falcon de 15 ml avec environ 5 ml de Sigmacote (Sigma) et inverser plusieurs fois.
2. Retirez la solution, placer le tube Falcon contenant les ca....

Résultats

Notre procédure d'isolement de l'embryon (figure 1) permet d'isoler jusqu'à 40 embryons à 4 heures si les lavages sont effectués, par exemple pour les applications moléculaires, ou en moins d'une heure si lavages sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. Figure 2 affiche haut et bas Conseils microcapillaires qualité et la figure 3 montre la configuration de la machine d'isolement de l'embryon. Figure.......

Discussion

Nous avons élaboré un protocole d'isolement de l'embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d'autres laboratoires.

L'équipement décrit ici se compose d'un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l'isolement de cellules animales unique pour l'analyse transcriptomique

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (technologies de la vie)	10777-019
Tampon premier brin	Invitrogen (technologies de la vie)	18064-022	contenu dans le package Superscript II
DTT	Invitrogen (technologies de la vie)	18064-022	contenu dans l’emballage de Superscript II
Albumine sérique bovine (BSA) 100x = 10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Différents fournisseurs travailleront également
Capillaires à paroi mince 1,0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0,5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ ; 30 μ ; m	PARTEC	04-0042-2316
Lames 5 puits de 10 mm de diamètre	Microscopie électronique Sciences	63421-10
Solution de formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus lame	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ; ser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS granulés	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Seringues à insuline microfines	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyseur Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
EQUIPMENT
Microscope inversé	Nikon TMS (Japon),
Micromanipulateur	Leitz
Leica Micomanipulator Sonde LH1 Post mount	Leica microsystems	39430101	Une marque différente fera également le travail
Extracteur de filament vertical	Instrument Sutter	modèle P-20	D’autres modèles conviennent également
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyseur	Agilent Technologies	2100
Fluorimètre Qubit	Invitrogen (technologies

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