Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.
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Article de méthode
Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination
Dans cet article
Résumé
Résumé
Glycémie non contrôlée est une caractéristique du diabète sucré et favorise morbidités comme la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie. Avec la prévalence croissante du diabète, à la fois auto-immune de type 1 et lié à l'obésité de type 2, des études visant à délimiter le diabète physiopathologie et les mécanismes thérapeutiques sont d'une importance critique. Les β-cellules d'îlots pancréatiques de Langerhans sont responsables de la sécrétion de l'insuline de façon appropriée en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. En plus du glucose et d'autres nutriments, les cellules β sont également stimulés par des hormones spécifiques, appelées incrétines, qui sont sécrétées par l'intestin en réponse à un repas et d'agir sur les récepteurs β-cellulaires qui augmentent la production d'adénosine monophosphate cyclique intracellulaire ( cAMP). Diminution de la fonction β-cellulaire, la masse, et la réactivité de l'incrétine sont bien comprises de contribuer à la physiopathologie du diabète de type 2, et sont de plus en plus liés wile diabète de type 1 e. L'isolement actuel de l'îlot de la souris et de l'AMPc protocole de détermination peut être un outil pour aider à délimiter les mécanismes favorisant la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques, en particulier ceux qui sont médiés par les récepteurs de l'incrétine ou récepteurs qui agissent par modulation de la production d'AMPc intracellulaire liée. Bien que seules des mesures d'AMPc vont être décrits, le protocole d'isolement des îlots de Langerhans décrit crée une préparation propre, qui permet également de nombreuses autres applications en aval, y compris le glucose stimulé la sécrétion d'insuline, la [3 H]-thymidine, abondance des protéines, et l'expression de l'ARNm.
Introduction
Le maintien strict de euglycémie est impératif de prévenir les pathologies telles que la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie, qui sont toutes des caractéristiques de la pathologie de incontrôlée de type 1 et 2 de diabète 1. Fonction β-cellulaire réduite et la masse à la fois de type 1 et diabète de type 2 perturbent les concentrations de glucose dans le sang 2. Alors que le type auto-immune 1 diabète résulte d'une perte dévastatrice de cellules β productrices d'insuline, troubles de β-cellulaire sécrétion d'insuline et périphérique signalisation de l'insuline dans le diabète de type 2, ainsi que de promouvoir l'hy....
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole est démontré a été réalisée sous la direction et l'approbation du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l'Université de Wisconsin-Madison.
Une. Préparation des solutions
- La méthode d'euthanasie dans ce protocole est exsanguination sous anesthésie Avertin (pour un examen des alternatives, voir Discussion). Pour faire Avertin, ajouter 0,625 g (1,25% ou 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoéthanol à 1,25 ml de 2-méthyl-2-butanol dans un t....
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Résultats
Pour assurer un rendement élevé au cours de l'isolement des îlots, des techniques chirurgicales décrites dans le protocole devraient être suivis de près. Bien que les techniques présentées ici seront adaptés à chaque laboratoire, il ya quelques étapes essentielles qui conduiront à un isolement réussi. Afin de rendre le canal cholédoque facilement accessible, il est recommandé que les organes soient déplacés vers le côté droit de la souris (Figure 1). En outre, cela permettra le pancréas à se déploie.......
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Discussion
Avec la prévalence du diabète devrait affecter 7,7% de la population mondiale, l'exigence de nouvelles techniques de recherche est impératif à la fois comprendre et traiter le diabète 18. L'isolement des îlots présente est un protocole bien établi utilisés pour l'expérimentation in vitro et a été présenté précédemment, avec de légères modifications 11,14,16. Bien que la sécrétion d'insuline est une application en aval commun pour des îlots isolés, en se concentrant sur les .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à révéler.
Remerciements
Nous tenons à remercier Renée L. Pasker et Harpreet K. Brar pour l'assistance technique d'experts sur les protocoles décrits dans ce travail. En outre, nous tenons à remercier le mentorat de Christopher B. Newgard à l'Université Duke et Alan D. Attie à l'Université de Wisconsin-Madison, avec le soutien des membres de leur laboratoire, qui nous ont permis le temps et le soutien nécessaires pour optimiser la protocoles décrits. En particulier, nous remercions Hans Hohmeier, Danhong Lu, et Helena Winfield dans le laboratoire Newgard et Marie Rabaglia dans le laboratoire Attie pour des discussions et des conseils productifs. Ce travail a été soutenu par l....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Collagénase de Clostridium histolyticum convient pour l’isolement des îlots actifs | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (poudre) | Invitrogen (Crédit : Gibco) | 31800-022 | |
| Albumine de sérum bovin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 Fil de suture en soie | Outils de science fine | 18020-30 | |
| Dumont #5 Pince | Outils de science fine | 11251-10 | |
| Pince de 0,8 mm ; ; | Outils de science fine | 11050-10 | |
| Ciseaux courbes | Outils de science fine | 14061-10 | |
| Vannas-Tü ; Bingen Ciseaux à ressort - Droit/Tranchant/8,5 cm/5 mm Tranchant | Outils de science fine | 15003-08 | |
| Ciseaux de dissection | Outils de science fine | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok Seringue | BD | 309646 | |
| 1 ml Seringue BD | BD | 309628 | |
| 30 G Aiguille BD 1/2 » Longueur | BD | 305106 | |
| 27 G Aiguille BD 1/2 » Longueur | Pierre | 305109 | |
| Outils scientifiques fins | 29008-01 | ||
| 2-2-2-tribromoéthanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-méthyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Chlorure de potassium | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Phosphate monopotassique (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Bicarbonate de sodium (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· ; 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· ; 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| Sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Références
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
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Réimpressions et autorisations
