Article de méthode

Une méthode pour la souris Isolement îlots pancréatiques et AMPc intracellulaire Détermination

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DOI :

10.3791/50374

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25 juin 2014

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1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Auteurs correspondants : Michelle E. Kimple <mkimple@medicine.wisc.edu>

Dans cet article

Résumé

Le dosage in vitro la fonction β-cellulaire en utilisant des îlots isolés de souris de Langerhans est un élément important dans l'étude du diabète physiopathologie et la thérapeutique. Alors que de nombreuses applications en aval sont disponibles, ce protocole décrit précisément la mesure intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) comme un paramètre essentiel de déterminer la fonction β-cellulaire.

Résumé

Glycémie non contrôlée est une caractéristique du diabète sucré et favorise morbidités comme la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie. Avec la prévalence croissante du diabète, à la fois auto-immune de type 1 et lié à l'obésité de type 2, des études visant à délimiter le diabète physiopathologie et les mécanismes thérapeutiques sont d'une importance critique. Les β-cellules d'îlots pancréatiques de Langerhans sont responsables de la sécrétion de l'insuline de façon appropriée en réponse à des concentrations élevées de glucose dans le sang. En plus du glucose et d'autres nutriments, les cellules β sont également stimulés par des hormones spécifiques, appelées incrétines, qui sont sécrétées par l'intestin en réponse à un repas et d'agir sur les récepteurs β-cellulaires qui augmentent la production d'adénosine monophosphate cyclique intracellulaire ( cAMP). Diminution de la fonction β-cellulaire, la masse, et la réactivité de l'incrétine sont bien comprises de contribuer à la physiopathologie du diabète de type 2, et sont de plus en plus liés wile diabète de type 1 e. L'isolement actuel de l'îlot de la souris et de l'AMPc protocole de détermination peut être un outil pour aider à délimiter les mécanismes favorisant la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques, en particulier ceux qui sont médiés par les récepteurs de l'incrétine ou récepteurs qui agissent par modulation de la production d'AMPc intracellulaire liée. Bien que seules des mesures d'AMPc vont être décrits, le protocole d'isolement des îlots de Langerhans décrit crée une préparation propre, qui permet également de nombreuses autres applications en aval, y compris le glucose stimulé la sécrétion d'insuline, la [3 H]-thymidine, abondance des protéines, et l'expression de l'ARNm.

Introduction

Le maintien strict de euglycémie est impératif de prévenir les pathologies telles que la neuropathie, la néphropathie et la rétinopathie, qui sont toutes des caractéristiques de la pathologie de incontrôlée de type 1 et 2 de diabète 1. Fonction β-cellulaire réduite et la masse à la fois de type 1 et diabète de type 2 perturbent les concentrations de glucose dans le sang 2. Alors que le type auto-immune 1 diabète résulte d'une perte dévastatrice de cellules β productrices d'insuline, troubles de β-cellulaire sécrétion d'insuline et périphérique signalisation de l'insuline dans le diabète de type 2, ainsi que de promouvoir l'hyperglycémie, la dyslipidémie, et augmentation de la production hépatique de glucose, ce qui entraîne par la suite dans à la fois la perte de masse β-cellulaire et de l'insuline sécrétoire capacité de β-cellules individuelles 3. Comprendre les mécanismes sous-jacents β-cellules dans la progression de type 1 et diabète de type 2, nous l'espérons donner lieu à de nouvelles thérapies pour prévenir et traiter ces maladies.

Dans ti vitrodes modèles de culture uestion, tels que l'INS-1 et MIN6 immortalisés lignes β-cellulaires, peuvent être des outils utiles pour la compréhension des fonctions spécifiques β-cellules. Cependant, les interactions entre les différents types de cellules au sein de l'îlot peut se réguler la fonction β-cellulaire. Par exemple, l'influence paracrine de glucagon (libérée à partir de cellules-α) et la somatostatine (libéré à partir des cellules-δ) en augmentant et en diminuant la sécrétion d'insuline, respectivement, démontre l'importance de la proximité de la cellule de la cellule dans la réponse endocrinienne 4. En outre, les jonctions communicantes entre les cellules-β potentialisent la libération d'insuline 5. En outre, bien que des progrès ont été réalisés dans la génération de lignées insulinome que mieux reproduits la réponse physiologique des îlots isolés au glucose (par exemple, l'INS-1 dérivé 832/13 et 832/3 lignées cellulaires), leur réactivité de glucose diffère encore de rat normal îlots 6,7. En outre, la réponse de ces lignées cellulaires d'insulinome clonalesde peptide-1 (GLP-1) des agonistes du glucagon-like peuvent différer considérablement les uns des autres, ainsi que de six îlots normaux. Par conséquent, les lignées cellulaires immortalisées peuvent ne pas représenter le meilleur modèle pour les agents de dosage ayant un impact sur la production d'AMPc.

Par contraste avec les lignées cellulaires dérivées insulinome, l'étude de la fonction β-cellulaire uniquement dans des modèles animaux entiers offre sa propre série de complications. Un des plus grands défis dans le travail avec le tissu endocrinien est de mesurer la concentration précise de l'hormone libérée. Plus précisément, le foie joue un rôle majeur métaboliser l'insuline, et le flux sanguin du pancréas va directement vers le foie. Ainsi, une mesure de l'insuline dans le plasma peut ne pas représenter avec précision les quantités d'insuline est sécrétée par le pancréas lui-même ou de l'incidence des différents traitements sur le taux de sécrétion de l'insuline 8. En outre, le métabolisme rénal de glucagon peut limiter la fiabilité de la production de glucagon par α-cellules d'îlots 9. Par conséquent, l'isolement d'îlots de souris primaires pour l'expérimentation in vitro fournit une compréhension plus précise de la façon dont l'îlot est de répondre à des stimuli spécifiques pour compléter les mesures effectuées in vivo.

Le présent protocole pour l'isolement des îlots de souris est un protocole bien établi utilisé par un certain nombre de groupes (avec de légères modifications qui peuvent aider à accroître la réussite) 10,11. En outre, la détermination de la production d'AMPc permet une lecture directe de la capacité de réponse des cellules incrétine-β. En conjonction avec la mesure de l'AMPc, la teneur en protéines et la sécrétion d'insuline peut également être quantifié à partir de la même préparation de l'échantillon de l'AMPc, aidant à déterminer si un défaut de la fonction β-cellule se trouve proximal ou distal par rapport à l'AMPc 10. La teneur en AMPc finale et l'insuline demande de sécrétion dans ce protocole peut être un outil très puissant pour comprendre l'influence des constituants pharmaceutiques et alimentaires, entre autres,s, sur l'AMPc et la sécrétion d'insuline. En plus de la stimulation de glucose seul, d'autres composés peuvent être utilisés pour mesurer les changements dans l'AMPc et la sécrétion d'insuline 10,11.

Enfin, bien que l'insuline est l'hormone principale nous dosage à partir de d'îlots isolés, d'autres hormones, telles que le glucagon et la somatostatine, ainsi que des cytokines, des eicosanoïdes, et l'adénosine monophosphate cyclique, peut également être mesuré, soit par un test de stimulation transitoire ou par quantification de leurs niveaux dans un milieu de culture 12. Enfin, bien que hors de la portée de ce manuscrit, l'isolement d'îlots avec le procédé d'isolement de la collagénase décrit permet une préservation des îlots de sorte que de nombreuses autres applications en aval peuvent être poursuivis, tels que la greffe d'îlots, l'isolement de l'ARN pour le temps réel de PCR quantitative ou microréseau analyses, protéine l'isolement de transfert de Western, îlot plongement et l'imagerie par immunofluorescence, et l'incorporation de [3H]-thymidine en tant que mesure de repli des cellules des îlotscation, dont certains ont été décrits dans les articles de JoVE précédentes 13 à 16. Dans l'ensemble, la suite de la procédure d'isolement des îlots décrite dans le protocole peut fournir un chercheur de l'information importante et utile pour le développement de thérapies et de promouvoir la découverte de médicaments visant à améliorer la fonction β-cellulaire.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole est démontré a été réalisée sous la direction et l'approbation du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) de l'Université de Wisconsin-Madison.

Une. Préparation des solutions

  1. La méthode d'euthanasie dans ce protocole est exsanguination sous anesthésie Avertin (pour un examen des alternatives, voir Discussion). Pour faire Avertin, ajouter 0,625 g (1,25% ou 44,2 mM) de 2-2-2 tribromoéthanol à 1,25 ml de 2-méthyl-2-butanol dans un tube conique de 15 ml et on chauffe à 37 ° C pendant 20 à 30 min. Vortex la solution à haute température pendant 10-15 secondes à la fois pour dissoudre complètement la tribromoéthanol 2-2-2. Une fois complètement dissout, ajouter la solution à 48,75 ml de la double H 2 O distillée, filtrer à travers un filtre de 0,45 um dans un nouveau 50 ml tube conique, envelopper les 50 ml coniquesal tube dans une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C pendant un mois. Amener le tube à la température ambiante avant l'injection des souris.
  2. Pour faire une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), porter 1 L 1x HBSS d'un stock 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) dans le double H2O distillée, ajouter 0,35 g (4,2 mM) Nacho 3, et magasin à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois. Pour chaque souris, 105 ml de cette solution (plus de 5-10 ml supplémentaires pour le pipetage erreur) seront nécessaires pour l'isolement des îlots.
  3. Îlots sont très sensibles aux dommages hypoxiques; Par conséquent, on fait barboter du HBSS avec 95% O 2/5% CO 2 pour imiter les concentrations de O 2 dans le sang. Mélanges de gaz spéciaux peuvent être achetés et une station de bullage mis en place avec une pipette Pasteur attaché à un tube flexible. Après barbotage de la quantité requise de HBSS avec 95% O 2/5% CO 2 pendant 15 minutes, ajouter 0,02% de BSA de qualité RIA (albumine de sérum bovin) en volume et de garder sur de la glace pour la remainder de l'isolement des îlots de Langerhans.
  4. Pour la préparation de Ficoll, peser 32,5 g de Ficoll dans un bécher de 400 ml, ajouter 80 ml de HBSS, et agiter à 500-700 rpm pendant 30 min. Une fois dissous, verser la solution de Ficoll dans 250 ml graduée et ajouter HBSS à la marque de 130 ml sur le cylindre gradué pour créer une solution de Ficoll 25%. Couvrez le dessus de l'éprouvette graduée avec deux portions de Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) et agiter vigoureusement à plusieurs reprises.
  5. Pour une solution de Ficoll 23%, 20,5% et 11%, ajouter 27,6, 24,6, et 13,2 ml de Ficoll 25%, respectivement, à 50 ml tubes coniques. Ensuite, amener chaque solution jusqu'à un total de 30 ml avec HBSS et bien agiter pour mélanger. Tous les quatre solutions de Ficoll doivent être conservés à 4 ° C et sont bonnes pour un maximum de 2 semaines.
  6. solution de collagénase qui est appropriée pour isoler les îlots actifs est préparée à partir de la collagénase de Clostridium isolé histolytiqueum (tableau des matériaux). Chaque lot doit être testé pour l'efficacité de l'enzyme. Typiquement, la collagénase est utilisée à 0,3 à 0,5 mg par ml de HBSS. Utilisant des concentrations d'enzymes dans cette gamme (habituellement 3 concentrations différentes), déterminer la qualité et la quantité des îlots isolés de souris ou même portée pour régler la concentration de l'enzyme de travail âge.
  7. Une fois que la concentration correcte est déterminée, chaque souris nécessite 35 ml de collagénase dans du HBSS pour l'ensemble du protocole d'isolement. Agiter la collagénase dans HBSS à se dissoudre. Immédiatement avant la chirurgie, pré-charger une seringue de 5 ml avec une solution de collagénase, placer la canule et à enlever les bulles d'air, et laisser sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
  8. Les milieux de culture d'îlots pour O / N est une incubation RPMI 1640 supplémenté médias. Pour la solution de stock, dissoudre un paquet RPMI 1640 (Gibco, New York) dans 1 L de la double H 2 O distillée et ajouter 1,19 g HEPES (5 mM) et 2 g Nacho 3 (24 mM). Ajuster le pH à 7,4,stériliser par filtration, et conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
  9. Pour les milieux supplémentés, ajouter 10% de FBS et 100 IU/100 pg / ml de pénicilline / streptomycine, respectivement, pour les actions du milieu RPMI 1640. Si une concentration différente de glucose est souhaitée, sans glucose du milieu RPMI 1640 peuvent être utilisés, et une concentration de glucose spécifique peuvent être ajoutés.
  10. Pour un stock tampon Krebs Ringer Bicarbonate (Krebs), ajouter les ingrédients suivants pour doubler l'eau distillée à des concentrations suivantes: NaCl (118,41 mM), KCl (4,69 mM), MgSO 4 (1,18 mM), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), Nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM), et CaCl2 (2,52 mM) à pH 7,4. CaCl 2 doit être ajouté en dernier et cette solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines.
  11. Pour faire un stock de travail de Krebs, premier gaz avec 95% O 2/182 5% de CO 2 pendant 10-15 min avec une pipette Pasteur à 37 ° C, suivie par l'addition de 0,5% de grade de RIA BSAen volume. Ensuite, le glucose est ajouté à la concentration désirée pour le dosage in vitro.

2. Préparation des outils

  1. Un peu émousser les pointes de 30 - et 27-G aiguilles en utilisant une pierre à aiguiser pour arrondir la pointe acérée. Mettez un coude à 45 degrés dans l'aiguille d'environ ¼ de pouce de la pointe à l'aide d'une paire de pinces. Veillez à ne pas serrer trop fort, qui fermer le diamètre interne de l'aiguille.
  2. Couper le fil 3/0 soie de suture dans environ longueurs de 4 pouces, un pour chaque souris.
  3. Couvrir le fond de microscope de dissection d'une pellicule plastique et ruban adhésif.
  4. Coupez plusieurs morceaux de papier absorbant banc, à environ 3 x 5 pouces de taille, pour au moins 2 pour la souris.

3. Préparation de la souris

  1. Remplir une seringue de 1 ml avec 1 ml d'Avertin.
  2. Injecter la solution Avertin par voie intrapéritonéale à environ 40 pi / gramme de poids corporel.
  3. Après la souris sans longer répond à queue ou pincées plantaires des pattes postérieures, de transférer avec précaution à la station de travail de dissection au microscope.
  4. Avec la souris dans la position couchée sur le dos et sa tête face distale, pulvériser la souris avec 70% d'éthanol aqueux. Assurez-vous d'utiliser une quantité suffisante d'éthanol à 70% afin de limiter la quantité de poils dans la cavité thoracique exposée.

4. L'ouverture de la cavité thoracique

  1. Pincez la fourrure et la peau de la souris entre les deux pattes de derrière et faire une coupe initiale à travers l'épiderme, le derme et membrane sous-jacente.
  2. Tout en pinçant la peau et de la membrane sous-jacente, couper vers l'aile avant des deux côtés de la souris en prenant soin d'éviter de couper tous les organes internes.
  3. Pliez la peau et le volet de la membrane sur la cage thoracique et enlever l'appendice xiphoïde pour faciliter l'accès au pancréas pour l'inflation.
  4. Réorienter la souris avec la tête face proximale et déplacer les organes internes vers le côté droit du travail station de révéler l'aorte descendante.
  5. Sauf tissu sanguin doit être collecté, l'aorte descendante peut être coupé à compléter l'euthanasie. Imprégnez-vous de l'excès de sang avec du papier de banc ou une Kimwipe pour faciliter l'accès à la voie biliaire principale.

5. Gonflage du pancréas

  1. Avec une loupe binoculaire, repositionner l'intestin grêle de sorte que le canal cholédoque forme une ligne perpendiculaire à la tête de la souris.
  2. Prenez une pince et saisir l'intestin grêle et trouver le sphincter d'Oddi (sphincter d'ampoule) à la fin de la voie biliaire principale, qui s'évase sur sur l'intestin grêle de la voie biliaire, formant un triangle blanc sur l'intestin rose. Une fois que le sphincter d'Oddi a été localisé, prendre # 5 pince Dumont et faites glisser la pointe en dessous de la voie biliaire principale aussi près de l'intestin grêle que possible, en prenant soin de ne pas percer le conduit.
  3. Après avoir percé à travers l'intestin grêle et du tissu conjonctif, en utilisant cepointe de l'Dumont Pince à saisir le fil de suture et tirez dans le canal cholédoque. Nouez le canal cholédoque au plus près du sphincter d'Oddi que possible, en s'assurant que le noeud est tendu pour éviter les fuites.
  4. Saisir les deux extrémités de la suture et tirez vers la queue pour mettre un peu de tension sur le canal cholédoque. L'utilisation d'un main libre, faire une petite incision avec les ciseaux micro dans le canal cholédoque juste au-dessus de la dernière bifurcation dans le foie. Remarque: Il est important de ne pas couper trop près du sphincter d'Oddi, car cela pourrait entraîner une inflation partielle du pancréas et éviter de couper à travers le canal cholédoque comme il sera également entraîner une mauvaise inflation.
  5. Tout en tenant les deux extrémités de la chaîne avec le canal cholédoque tendu, retirer la seringue / canule qui a été pré-chargé avec 5 solution de collagénase ml du seau à glace, déposer la seringue, et insérer l'aiguille 30 G émoussé dans la coupe canal cholédoque, en faisant attention de ne pas percer le par le wall du conduit. Si l'aiguille 30 G n'est pas assez large pour les voies biliaires pour former un joint autour, retirez-le et remplacez-le par 27 aiguille G émoussé.
  6. Tout en maintenant l'aiguille en place, relâchez la suture et ramasser la seringue de 5 ml. Enfoncez lentement le piston de la seringue. Remarque: Si l'aiguille a été insérée avec succès dans le canal cholédoque, il va étendre.
  7. Continuer à appuyer sur le piston lentement et laisser hors de façon pulsatile jusqu'à ce que la première partie du pancréas gonfle, suivie par une pression constante doux jusqu'à ce que le pancréas ne gonfle. Remarque: La plupart pancréas détiennent 3-5 ml avant de commencer à fuir. En outre, une inflation retenu doit avoir une distribution uniforme de tissu exocrine et la partie du pancréas au-dessus de l'estomac sera gonflé.
  8. Retirez l'aiguille de la voie biliaire principale et mis sur le côté.

6. Pancréas enlèvement

  1. Prenez une pince dans une main et une paire de ciseaux courbes enl'autre. Utilisation de la pince, saisir l'intestin grêle au niveau du sphincter d'Oddi. Avec les ciseaux fermés, utiliser la pointe à une partie distincte du pancréas de l'intestin grêle.
  2. Répartir les ciseaux part à élargir le fossé entre l'intestin grêle et le pancréas.
  3. Placer le "V" de la paire de ciseaux, où le petit intestin et le pancréas se fixent les uns aux autres sur le côté droit de la fente qui vient d'être faite. Utilisation de la pince tirez doucement l'intestin grêle passé les ciseaux pour enlever le pancréas.
  4. Continuez à travailler vers le bas l'intestin grêle pour le tissu conjonctif rose. À ce stade, ramasser de l'intestin grêle près de son point d'attache à l'estomac et le pancréas couper l'écart du reste de l'intestin grêle. Remarque: Veillez à ne pas couper le pancréas comme il peut commencer à se dégonfler.
  5. Saisir délicatement la partie du pancréas attachés à l'estomac avec une pince (pince plats qui fonctionnent le mieux). Tout en tirant doucement sur le pancréas, utiliser la courbeciseaux pour couper d écart au niveau des connexions entre le pancréas et de l'estomac.
  6. Localiser la rate et maintenez-le avec la pince au-dessus du pancréas. Prenez les ciseaux courbes et couper les liens entre la rate et le pancréas.
  7. Trouver l'endroit où le pancréas est attaché au gros intestin. Décrochez le gros intestin avec une pince et utiliser la pointe des ciseaux à pointer à travers. Etaler les ciseaux de l'autre que, avant de générer un décalage entre le gros intestin et le pancréas.
  8. Retarder le gros intestin avec une pince: cela se traduira par le pancréas avalée, en exposant ses connexions précises dans le gros intestin. Snip loin les connexions restantes.
  9. Trouver le tissu conjonctif rose attaché à le pancréas et l'intestin grêle et couper au plus près du pancréas que possible. Remarque: Si percer le pancréas est un problème, il est conseillé de couper plus proche de l'intestin grêle comme le tissu conjonctif sera filtré dans les étapes ultérieures.
  10. Solrab autant du pancréas que possible et soulevez-le doucement. Avec des ciseaux courbes, couper les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique pour éliminer entièrement le pancréas. Remarque: Le pancréas doit toujours être gonflés si retiré correctement.
  11. Stocker le pancréas prélevés dans ~ 2,5 ml de solution de collagénase dans un tube conique de 50 ml sur de la glace jusqu'à ce que toutes les autres pancréas ont été gonflé et retiré pour l'expérience.

7. Laver

  1. Prendre toutes pancréas isolés et les déplacer à séparer 50 ml tubes coniques contenant chacun 25 ml de solution de collagénase frais
  2. Placez les 50 ml tubes coniques en position verticale dans un 37 ° C en secouant bain d'eau capable d'osciller à 220-250 rpm, avec le shaker éteint.
  3. Gazer chaque tube conique de 50 ml avec 95% O 2/5% CO 2 pendant 5 min avec une pipette Pasteur.
  4. Refermer chaque tube hermétiquement et placer sur le côté dans l'eau en secouantbain en dessous de la surface de l'eau. Secouez à 220-250 rpm pendant 20 secondes, à chaque minute, à 16 min à partir de 6 min. (Agiter à 6, 8, 10, 12, 14, et 16 min)
  5. Transférer immédiatement les tubes dans une centrifugeuse à température ambiante pour une rotation rapide. Apportez la centrifugeuse à 1500 tours par minute (400-500 g) et éteignez immédiatement.
  6. L'utilisation d'un piège à vide, aspirer environ de 22,5 ml de la solution de collagénase, sans perturber le culot. Laver avec 10 ml de HBSS et vortex doucement pour briser le culot.
  7. Effectuez une autre tour rapide à la température ambiante jusqu'à 1500 tours par minute (400-500 g).
  8. Aspirer environ 10 ml de la solution, de nouveau sans perturber le culot.
  9. Laver avec encore 10 ml de glace froide HBSS et vortex doucement pour briser une fois de plus le culot. Répétez les retombées et aspirer rapidement 10 ml de la solution.
  10. Vortex doucement le culot dans 2,5 ml restants de solution HBSS. Verser la solution1.000 um maille dans un nouveau 50 ml tube conique. Cela permettra d'éliminer les débris de tissu grand pas digéré par la collagénase.
  11. Rincer la vieille 50 ml tube conique avec 2,5 ml de glace froide HBSS. Utiliser une pipette Pasteur pour rincer les parois du tube à fond avant le transfert de la 2,5 ml de HBSS à travers les mailles dans les nouveaux 50 ml de tube conique.
  12. Effectuez une autre tour rapide à la température ambiante à 1500 tours par minute (400-500 g) pour sédimenter le tissu.
  13. Aspirer la totalité du HBSS en inclinant le tube vers le piège à vide. Remarque: Il est très important de ne pas perturber le culot, car cela entraînerait la perte d'îlots. Si la pastille est lâche ou commence à se déplacer vers le piège à vide, arrêter aspiration de la solution et re-sédimenter le tissu et puis continuer à aspirer la solution restante.
  14. Une fois que la totalité du HBSS a été éliminée, ajouter 4,8 ml de solution de Ficoll à 25% et de vortex pour disperser le culot.
  15. Couche avec précaution 2,4 ml de 2Solution de Ficoll 3% au-dessus de la solution de Ficoll à 25% par addition de la solution de 23% de Ficoll sur le côté du tube conique de 50 ml. Pour assurer une mise en couches, faire tourner le tube conique de 50 ml lors de l'ajout de la solution de Ficoll.
  16. Répétez le processus de stratification pour 20,5% et les solutions de Ficoll 11%. Remarque: Si 4 couches distinctes ne sont pas présents, ajouter HBSS jusqu'à la marque de 50 ml et inverser le tube 4-6 fois ou jusqu'à ce que le gradient de Ficoll n'existe plus. Re-sédimenter le tissu et réessayer étapes 7.14 à 7.16.
  17. Spin le tube conique de 50 ml à la température ambiante à 1820 tours par minute (800 g) pendant 15 min.
  18. Verser tout le Ficoll 50 ml dans un tube frais conique, en ayant soin de laisser la pastille de tissu exocrine derrière. Ajouter de la glace froide HBSS jusqu'à la marque de 50 ml et inverser le tube 4-6 fois pour mélanger le Ficoll et HBSS ensemble.
  19. Spin le tube conique de 50 ml à la température ambiante à 1820 tours par minute (800 g) pendant 5 min.
  20. Aspirer délicatement la plupart du mélange HBSS / Ficoll en utilisant un tra videp. Ne pas perturber le culot qu'il est lâche et peut être aspiré facilement.
  21. Prenez une pipette Pasteur et transférer le culot dans un tube de culture jetable.

8. Choisir îlots

  1. Ajouter 5 ml de milieu de prélèvement (par exemple. RPMI 1640 ou Krebs Ringer Bicarbonate tampon) sur le tube de culture jetable. Remarque: Les médias cueillette varient en fonction des applications en aval.
  2. Laissez les îlots se déposent au fond du tube de culture pendant 5 min. Les transférer à l'aide d'une pipette Pasteur à un 15 mm par 60 mm de polystyrène plat de Pétri. Remarque: Il est important d'utiliser une boîte de Pétri que ceux-ci ne sont pas traités et permettra d'éviter les îlots d'adhérer à l'antenne.
  3. Dans un 15 mm séparée par 60 mm de polystyrène boîte de Pétri, ajouter 5 ml de la souris milieux de culture d'îlots (100 ml RPMI 1640 Stock médias, 10 ml inactivé par la chaleur FBS, 1 ml Pen / Strep; filtre stérilisés).
  4. Avec l'aide d'une loupe binoculaire avec backligcapacité de ht, utiliser une pipette P-20 pour prendre les îlots dans la boîte de Pétri contenant îlot milieux de culture, en prenant soin d'éviter de transférer des débris de tissu acinaire. Lorsque rétro-éclairé, îlots apparaissent brun-or et leur membrane externe peuvent briller, tout en tissu acinaire apparaît en gris clair et terne. Si la préparation de l'îlot contient une grande quantité de débris, il est conseillé de sélectionner manuellement îlots à deux reprises dans un milieu frais. Réduire la contamination des débris limiter îlot agglutination après une nuit d'incubation. Ajout DNAse (3000 U / ml) dans le tampon de digestion peut aussi aider à limiter îlot agglutination (JWJ, observation personnelle). Remarque: Il est important de compter le nombre d'îlots isolés pour planifier des expériences en aval.
  5. Incuber les îlots O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 5% de CO 2.

9. AMPc Assay

  1. Étiqueter 1,7 ml microtubes de, un pour chaque répétition de l'essai. Remarque: des tests de camp doit avoir au moins duplicates pour chaque condition de traitement, mais plus de répétitions par traitement sont préférés.
  2. Après dégazage du tampon bicarbonate de Krebs Ringer pendant 15 min avec 95% O 2/5% de CO 2 avec la pipette de Pasteur, ajouter 0,5% de BSA de qualité RIA et une concentration de glucose finale de 1,7 mM (solution de pré-incubation). Puis, ajouter 1 ml de Krebs fraîchement gazés à chaque tube de centrifugeuse. Deux ml de Krebs est requis par tube pour les points de pré-incubation et le temps de traitement; mais il est recommandé de préparer au moins 5-10 ml supplémentaire.
  3. Agiter les îlots au milieu de la boîte de Petri, et à l'aide d'une pipette P-20, la main-choisir les îlots à un nouveau 15 mm par 60 mm de polystyrène boîte de Pétri contenant 5 ml de la solution de pré-incubation à laver le milieu de culture contenant du glucose des îlots.
  4. Le kit de dosage de l'AMPc utilisé est le GE Healthcare AMPc direct BioTrak EIE. Ledit protocole utilisé est une modification de celui décrit pour le "meas d'AMPc intracellulairesurement utilisant la procédure acétylation non EIA avec les nouveaux réactifs de lyse », et a été optimisé pour une utilisation avec le nombre minimum d'îlots par tube, ce qui permet une augmentation du nombre de conditions de traitement et les répétitions techniques. L'utilisation d'un P-20 pipette, le transfert d'au moins 13 îlots dans chaque tube de l'étape 9.2, le maintien de la cohérence entre les îlots taille des tubes, avec 1 ml de tampon de pré-incubation. Remarque: Augmenter le nombre de répétitions est plus bénéfique que le nombre d'îlots par tube. Toutefois, s'il ya suffisamment de îlots pour accroître le nombre d'îlots par tube uniformément, il est conseillé de le faire, jusqu'à 25-50 îlots par tube.
  5. Avec les bouchons de tubes de micro ouvert, transférer dans un incubateur à 37 ° C fixé à 5% de CO 2 et incuber pendant 45 min à normaliser la sécrétion de l'insuline de tous les îlots à un niveau de base.
  6. Bien que les échantillons sont en période d'incubation, préparer les traitements (soit 8 mM, 11,1 mM, glucose mM 16,7, etc) dans le Krebs fr gazésom l'étape 9.2. dans 15 ml tubes coniques, avec 1 ml supplémentaire pour tenir compte de toute erreur de pipetage. Ajouter 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) à une concentration finale de 200 uM. IBMX est un inhibiteur de la phosphodiestérase générale qui bloque la dégradation de l'AMPc, ce qui permet d'accumuler de l'AMPc dans la cellule telle qu'elle est produite. (Remarque:.. C'est un essai de production d'AMPc vrai Voir la section de discussion pour les cas où la mesure de la production d'AMPc peut-être pas souhaitable Si IBMX est exclu de l'analyse, plus îlots seront tenus par tube afin d'obtenir des données d'AMPc dans le plage linéaire de la courbe étalon).
  7. Après la 45 min de pré-incubation, enlever les tubes à centrifuger de l'incubateur, casquette et d'impulsion vortex chaque échantillon (moins de 0,5 sec). Il s'agit de mélanger le gradient de l'insuline qui a été probablement généré en raison des îlots étant concentrés dans la partie inférieure du tube. Il faut prendre soin de ne pas trop durement vortex, car cela pourrait nuire à la stabilité de l'îlot (Note: Plafonnétubes avec îlots peuvent être légèrement effleuré ou inversés si il n'est pas possible d'impulsion vortex doucement. Ces options seront ajouter le temps de l'analyse, qui doit être considéré lors de la planification de l'expérience).
  8. Transférer chaque tube à une centrifugeuse de paillasse (RT) et de spin jusqu'à ce que les îlots atteignent 10,000 rpm (7,000-7500 g) puis s'éteignent immédiatement.
  9. Utiliser une pipette P-1000 pour éliminer la majeure partie du Krebs dans chaque tube de centrifugeuse, en laissant environ 10 à 15 ul de Krebs sur le culot d'îlots de Langerhans. Utiliser une pipette P-20 pour éliminer la partie la plus proche du culot de l'îlot. Si culot est perturbé, la pipette Krebs dans le tube et re-spin.
    (Remarque: Si l'expérimentateur trouve trop difficile à enlever tout le Krebs du culot îlot sans le déranger, le dernier 10-15 pi peut être laissé sur et pris en compte dans le volume total tard dans le protocole.
  10. Obtenir une quantité suffisante de l'azote liquide dans un contenant isolé pour casser le gel des échantillons après incubation.
  11. Prenez les échantillons de l'incubateur, casquette, vortex rapidement (moins de 0,5 sec) tourner les tubes à centrifuger dans une centrifugeuse de paillasse (RT) à 10 000 tours par minute (7,000-7500 g), puis immédiatement arrêté. Si l'insuline ou autre métabolite est une application en aval souhaitée, utiliser une pipette P-1000 pour recueillir une aliquote de milieu dans un tube de centrifugeuse et conserver à -20 ° C jusqu'à analyse plus approfondie. Si le support de stimulation ne sont pas recueillies, il peut être mis au rebut.
    (Remarque: IBMX une forte potentialisation de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) Par conséquent, les résultats obtenus à partir de GSIS milieu de stimulation de l'AMPc peuvent ne pas représenter exactement le véritable effet des traitements spécifiques sur GSIS, surtout si ces effets sont subtils.).
  12. Répétez l'étape 9.9 pour enlever le plus moyen de stimulation que possible sans perturber le culot d'îlots. Aligner geler le culot d'îlots dans l'azote liquide une fois qu'il ya moins de 10-15 pi de Krebs à gauche sur la pastille d'îlots. Une fois toutes leséchantillons ont été congelés pression, conserver à -80 ° C jusqu'à la mesure de l'AMPc.
  13. Le jour de la détermination de l'AMPc, de préparer les nouveaux réactifs de lyse selon le protocole du fabricant. Ajouter 200 ml lyse réactif 1B pour chaque tube de centrifugeuse et tourbillon à la vitesse supérieure pendant 30 sec. Laissez les tubes sont assis sur la glace pendant 10 min, vortex toutes les 2 min 30 sec. (Remarque: Le protocole recommande de procéder à une analyse microscopique au bleu trypan pour assurer la lyse cellulaire, mais ce n'est pas effectuée pour des îlots).
  14. Préparer les normes de travail et de mettre en place la microplaque EIA exactement comme décrit dans le protocole du fabricant. Après que le substrat de l'enzyme a été incubée avec la microplaque pendant 30 min, réaliser l'étape 1.0 M d'acide sulfurique en option, et déterminer l'absorbance des puits de la microplaque à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaque.
  15. Résultats d'AMP cyclique seront comptabilisés comme fmole / bien. Cela devrait être normalisée pour le volume total de l'échantillon d'origine (200 pi + touteKrebs résiduel laissé sur les îlots de l'étape 9.9). Ensuite, les résultats peuvent soit être normalisées pour le nombre total d'îlots, donnant fmol AMPc produite / îlot, ou des échantillons de lysat peut être soumis à l'acide bicinchoninique de dosage (BCA) des protéines de normaliser les résultats de la protéine cellulaire totale (donnant protéine fmol / ug) . Ce dernier est recommandé lorsque la taille des îlots sont incompatibles entre les échantillons, et peut être un substitut pour la taille des îlots. Le kit de dosage de protéines BCA de Pierce a été utilisé avec succès dans ce protocole, et ne nécessite que 25 ml d'échantillon. Les normes BSA devraient être préparés dans la lyse réactif 1B du kit de dosage de l'AMPc.

Résultats

Pour assurer un rendement élevé au cours de l'isolement des îlots, des techniques chirurgicales décrites dans le protocole devraient être suivis de près. Bien que les techniques présentées ici seront adaptés à chaque laboratoire, il ya quelques étapes essentielles qui conduiront à un isolement réussi. Afin de rendre le canal cholédoque facilement accessible, il est recommandé que les organes soient déplacés vers le côté droit de la souris (Figure 1). En outre, cela permettra le pancréas à se déploient avec une petite quantité de résistance car il y aura extension de poids restreindre moins. Une autre étape importante pour maximiser le rendement d'îlots est la ligature de la voie biliaire principale à proximité du sphincter d'Oddi (figures 2A-C). Ligaturant plus loin de l'sphincter d'Oddi peut entraîner un gonflage partiel en réduisant la quantité de solution de collagénase entrant dans le canal pancréatique principal. En outre, un nœud serré empêchera solution de collagénase de pénétrer l'intestin.

Une incision appropriée dans le canal cholédoque doit être situé assez loin de la bifurcation du foie, mais assez proche de l'inflation du pancréas maximale (Figure 3). Une incision faite trop près de la bifurcation peut conduire à l'écoulement de la solution de collagénase dans le foie. Lorsque la solution de collagénase entre dans le foie, il perdra sa couleur rouge foncé et de commencer à devenir blanchâtre. Si cela se produit, retirez l'aiguille et essayez une autre canule en outre par le foie. En outre, la voie biliaire principale incision ne doit être en partie par le conduit (environ 50%). Complètement cisaillement conduit, il sera difficile pour sceller le conduit autour de la pointe de l'aiguille. Une incision adéquate se traduira par la fermeture complète de la conduite autour de l'aiguille, produire suffisamment de pression à la fois remplir le cholédoque et canaux pancréatiques (figure 4A). Il est également important de veiller à ce que l'aiguille a pénétré dans le conduit commun de la bile et non de la gaine environnante.Une fois que l'aiguille a été insérée correctement, 5 ml de la solution de collagénase doivent remplir le pancréas, la création d'un tissu marbré.

Le processus de suppression de pancréas doit être effectué très délicatement pour favoriser le rendement d'îlots maximale (Figure 5). Perçage du pancréas peut provoquer un dégonflage et la perte de solution de collagénase, ce qui réduit le rendement d'îlots de Langerhans. Couper le pancréas à proximité de tissu conjonctif et d'autres organes empêche la déflation. En outre, un autre tissu récolte, tel que le tissu conjonctif, ainsi que le pancréas n'est pas un problème, car elle sera éliminée dans les étapes ultérieures. A pancréas correctement retirés resteront gonflés après l'excision avant de poursuivre digestion à la collagénase (Figure 6).

Couches distinctes dans le gradient de Ficoll mèneront à une préparation d'îlots propre et créer un environnement plus facile pour la cueillette des îlots (figure 7). Le gradient assure la séparation des îlots dedes débris cellulaires et du tissu conjonctif qui reste après la digestion et l'écran maillé de filtrage. En outre, cette étape est cruciale pour sélectionner propres, îlots sains pour les applications en aval. Plus précisément, les îlots sains seront de forme sphérique et avoir un brun doré à centre brun foncé (figure 8). Remarque: Les îlots des souris diabétiques seront beaucoup plus pâle, correspondant à une diminution de la teneur en insuline, et peuvent être mieux distingué de tissu acinaire par leur forme, leur brillance et leur réseau de capillaires visibles. Toutes les îlots connectés au tissu acinaire ne doivent pas être utilisées et doivent être jetés. En outre, les grands îlots qui se développent, un centre nécrotique noir après une nuit d'incubation doivent être jetés car ils ne fonctionnent pas correctement.

Comme décrit dans l'introduction, la production d'AMPc est un composant important de la fonction β-cellulaire; en particulier, en ce qui concerne l'action des incrétines. L'un des avantages le protocole décrit dans le présent rencontré hod est que l'on peut obtenir simultanément la production d'AMPc et données sécrétion d'insuline stimulée par le glucose. En général, l'impact d'un agent sur ​​la production d'AMPc corrélation directe avec son impact sur ​​la sécrétion d'insuline 17. Pour les expériences simples, cette règle vaut assez bien (voir la figure 9 pour un exemple). Dans le présent protocole, nous utilisons IBMX (un inhibiteur de la phosphodiestérase) dans nos traitements pour prévenir le catabolisme de l'AMPc, donnant la production totale de l'AMPc.

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Figure 1. Déplacement organes internes. Positionnement des organes internes à la droite de la souris crée un environnement de travail plus facile et permet à la chambre de pancréas to expand pendant le gonflage.

Figure 2 "fo: contenu width =" 5 po "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figure 2. Lier hors du sphincter d'Oddi (AC). Dépeint ici est l'entrée de la voie biliaire vers l'intestin grêle au niveau du sphincter d'Oddi. Ligaturer le canal cholédoque au niveau du sphincter d'Oddi empêche solution de collagénase de pénétrer dans les intestins.

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Figure 3. Commune de l'incision de la voie biliaire. Il est préférable de faire une coupe dans le canal cholédoque légèrement distale par rapport à la bifurcation dans le foie pour empêcher l'écoulement de la solution de collagénase dans le foie.

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Figure 4. Canulation du canal cholédoque par une aiguille 30 G émoussée et le pancréas inflation. A) L'aiguille 30 G est inséré dans la voie biliaire principale, la création d'un joint d'étanchéité autour de la pointe de l'aiguille. Il est important de vérifier et de noter que l'aiguille a été insérée dans le canal biliaire commun et non de la gaine environnante. Une aiguille insérée correctement aura un aspect opaque. B) Une inflation du pancréas bon se remplira d'environ 3-5 ml de solution de collagénase et ont un aspect marbré.

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Figure 5. L'élimination du pancréas. A) L'incision initiale faite avec une paire de ciseaux courbes se produit près du sphincter d'Oddi. Le rem initialeovale commence dans la direction de l'estomac en prenant soin de ne pas perforer le pancréas. B) La dernière étape consiste à éliminer le pancréas du tissu conjonctif sur l'intestin grêle et les dernières connexions vers la cavité péritonéale.

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Figure 6. Les pancréas gonflés. Une élimination du pancréas réussie donnera un pancréas perfusé avec la solution de collagénase. Mauvais excision laisse un plus petit, le pancréas dégonflé.

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Figure 7. Quatre couches du gradient de Ficoll. Les quatre couches distinctes représentent une différenciationdensité Ficoll t de 25% en bas de 11% au sommet. La stratification distincte est impératif d'enlever les débris et exocrine désuétude des îlots.

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Figure 8. Sélection Islet. Îlots sains ont tendance à avoir un brun doré à brun foncé avec une forme sphérique ronde et ne sont pas connectés à acineuses tissu. Après une nuit d'incubation (16-20 h) un centre nécrotique se développe dans les grandes îlots, qui devraient être exclus de l'expérimentation.

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Figure 9. Des résultats de la production d'AMPc représentatifs de haute qualité, ce qui démontre que isol sécrétéeen peut être mesurée à partir du milieu de stimulation de l'AMPc. A) îlots isolés à partir de souris knock-out de type sauvage ou d'un gène ont été stimulées avec du glucose de 11,1 mM et la production d'AMPc intracellulaire a été mesurée et normalisée à la protéine cellulaire totale. B) insuline sécrétée a été mesurée en utilisant une insuline ELISA standard, et également normalisée à cellulaire total protéine. Dans de nombreux cas, la variation de la production d'AMPc est en corrélation directe avec l'augmentation du glucose stimulé la sécrétion d'insuline. n = 3 pour chaque groupe; *, P <0,05. Ce chiffre a été adapté à partir de la recherche publiée dans Kimple et al 10.

Discussion

Avec la prévalence du diabète devrait affecter 7,7% de la population mondiale, l'exigence de nouvelles techniques de recherche est impératif à la fois comprendre et traiter le diabète 18. L'isolement des îlots présente est un protocole bien établi utilisés pour l'expérimentation in vitro et a été présenté précédemment, avec de légères modifications 11,14,16. Bien que la sécrétion d'insuline est une application en aval commun pour des îlots isolés, en se concentrant sur les constituants en amont, tels que l'AMPc, peuvent aider à délimiter les mécanismes de potentialisation la production d'insuline et la sécrétion.

Le choix de l'euthanasie doit être effectuée avec soin afin de garantir à la fois le traitement sans cruauté des animaux de laboratoire ainsi que l'intégrité des mesures expérimentales. Pour l'isolement des îlots, exsanguination sous anesthésie est notre méthode préférée pour l'euthanasie car elle permet îlot perfusion de sang oxygéné pour la quantité maximale de temps avant le pancréasinflation. Inhalation de CO 2 est un mauvais choix pour l'euthanasie, comme si elle est effectuée selon des protocoles humanitaires, il expose les îlots de sang mal oxygéné pendant au moins 5-6 min avant la procédure peut commencer. Dislocation cervicale sans anesthésie pourrait être une méthode acceptable de justification scientifique, mais cela nécessiterait une expérience significative à la fois la méthode d'euthanasie et la dissection de la souris et du pancréas procédure d'inflation afin de s'assurer de la mort humaine et la préservation de la fonction des îlots. En choisissant exsanguination sous anesthésie, Avertin est l'anesthésique préféré dans ce protocole. Le choix particulier de Avertin est qu'il s'agit d'une action rapide et anesthésie profonde avec de nombreux avantages par rapport à d'autres anesthésiques couramment utilisés. Tout d'abord, ne se dilate pas Avertin vasculaire et induit la libération d'oxyde nitrique, comme le fait l'isoflurane 19. Îlots pancréatiques sont très vascularisées, et donc leur biologie, peuvent être affectés par exposur isofluranee. Deuxièmement, Avertin ne soulève pas excessivement les niveaux de glucose dans le sang en l'absence d'injection de glucose, comme on peut la kétamine / xylazine, qui a été montré pour élever la glycémie de 167% jusqu'à une heure après l'injection 20. Enfin, la gamme thérapeutique pour pentobarbital est très étroit chez la souris 21, augmentant les risques de dommages hypoxiques sur les îlots.

Dans le présent protocole, l'utilisation de fil de suture à ligaturer le canal cholédoque près du sphincter d'Oddi est utilisé comme une alternative à une pince hémostatique. La méthode de fil permet une plus grande maniabilité de la voie biliaire principale et la position de l'aiguille permet de cathétérisme. Cependant, l'utilisation de fil au cours de cette étape nécessite la tenue de deux objets (fil et de seringues), alors que la pince hémostatique permet une main libre pour aider à positionner la voie biliaire. Les deux techniques d'isolement donnent un nombre similaire de et îlots viables comme le montre avec des travaux antérieurs dans notre laboratoire et autres 10,22. En outre, une canule neetaille DLE, la position et l'angle dépendra des préférences de l'utilisateur. Plus précisément, une aiguille 30 G est utilisé dans ce protocole, mais d'autres tailles peut être nécessaire en fonction de souche ou d'origine génétique. Par exemple, les souris ont BTBR un canal cholédoque très friable et un plus gros calibre peuvent fournir une plus grande étanchéité autour de la pointe de l'aiguille (MEK, observations personnelles). Ainsi, il est recommandé d'avoir émoussé les aiguilles de la canule de différentes tailles sur la main au cours de la chirurgie, prêt à passer si nécessaire. La position de l'aiguille dans le canal cholédoque aura également un impact fortement le rendement de l'îlot. Si l'aiguille est placée en face de la bifurcation de la voie biliaire principale, une solution de collagénase entrera dans le foie et se traduire par un mauvais gonflage. Toutefois, si l'aiguille est placé trop près du sphincter d'Oddi, une inflation pancréatique partielle aura lieu, en diminuant le nombre d'îlots isolés. Inflations pancréatiques essais avec différentes tailles d'aiguilles et emplacements sur le canal cholédoque seront exirouge à personnaliser la présente procédure et maximiser le rendement de l'îlot.

Un autre élément important de cette procédure pour augmenter le nombre d'îlots viables est de préparer tous les réactifs selon les instructions des protocoles. Gazage les tampons avec 95% O 2/5% CO 2 pour augmenter l'oxygénation peut un facteur de survie d'îlots de Langerhans dans l'ensemble du protocole. Des travaux antérieurs montrent que la concentration en oxygène diminue vers l'intérieur de l'îlot, qui pourrait réduire la teneur en énergie de la β-cellules 23. Cela peut se manifester après une incubation d'une nuit en tant que, un centre nécrotique foncé apparaît dans les îlots de culture, en corrélation avec une diminution de la réactivité in vitro. Ainsi, fournir suffisamment d'oxygène contribuera à augmenter le nombre d'îlots et de la viabilité pendant l'isolement et dans le processus d'incubation normoxique nuit. En outre, une bonne préparation de la solution de collagénase permettra d'améliorer la digestion du tissu pancréatique et libérer til îlots du tissu environnant. Si la concentration de collagénase est trop faible, non seulement le rendement des îlots est faible, mais le tissu exocrine acineuse peut rester attaché aux îlots, affectant négativement les applications en aval. D'autre part, trop élevé d'une concentration de collagénase peut détruire les îlots. Par conséquent, les mesures de contrôle de la qualité propres à assurer l'efficacité de la collagénase de digestion sans la destruction d'îlots favoriseront de meilleurs rendements.

Collagénase de Clostridium isolé histolyticum est l'enzyme utilisée pour libérer les îlots de tissu pancréatique dans ce protocole. La reproductibilité de l'activité enzymatique entre les différents lots de la collagénase a le potentiel d'entraver la quantité et / ou la qualité des îlots isolés. Dans le présent protocole, chaque nouveau lot de collagénase enzyme passe par une vérification du contrôle interne de la qualité pour déterminer à la fois la quantité et la fonctionnalité des îlots avant qu'ils ne soient soumis à étudier. Par conséquent, downstrapplications EAM et beaucoup variation doivent être considérés lors du choix d'une enzyme pour l'isolement des îlots. Libérase ® (Roche), un mélange de collagénase purifiée, est une autre alternative enzyme digestive qui a été couronnée de succès dans de nombreux cas; en particulier, dans l'obtention de quantités plus élevées d'îlots isolés 24,25. Cependant, l'utilisation de la Liberase peut ne pas être avantageux pour isoler les îlots fonctionnels, car elle peut gêner la fonction vitro 26.

Beaucoup de limitations existent dans les procédures d'isolement des îlots et la détermination de l'AMPc présents qui pourraient nuire à des applications en aval. Comme indiqué précédemment, les souris ont BTBR un canal cholédoque très fragile, ce qui augmente la difficulté de gonflage du pancréas et isolement des îlots ultérieure. Par conséquent, la mise en commun préparations d'îlots de plusieurs souris peuvent être nécessaires, comme de nombreux essais in vitro, y compris le dosage de l'AMPc décrit, nécessitent de nombreux îlots par répétition. En outre, en utilisant IBMX dans le bloc de dosage de l'AMPcl'activité de la phosphodiestérase, ce qui donne une température lue de la production d'AMPc. Ajout de IBMX peut ne pas être recommandé dans les cas où le cycle de la production d'AMPc et de la dégradation est importante pour la signalisation cellulaire. Toutefois, la suppression IBMX de ce protocole réduit considérablement la teneur en AMPc finale des îlots, ce qui nécessite l'ajout de nombreux îlots plus par répétition afin d'obtenir des valeurs d'AMPc significatives dans l'EIE.

Le présent protocole est un outil essentiel pour un laboratoire de biologie îlot ou ceux qui sont intéressés dans le pancréas endocrine. La composante de l'AMPc à ce protocole est juste un des nombreux des expériences in vitro de comprendre comment la manipulation îlot par divers traitements peut améliorer ou émoussée la sécrétion d'insuline. Bien que la plupart des recherches en utilisant les îlots se concentre principalement sur ​​β-cellulaire sécrétion d'insuline, d'autres types de cellules peuvent être évalués pour leurs relations dynamiques au sein de l'îlot 4. En combinaison avec d'autres in vitro et in modèles in vivo, îlot expérimentation va faire la lumière sur les mécanismes sous-jacents des maladies dévastatrices pancréatiques liées comme le diabète et l'insulinome. Plus important encore, de comprendre comment des agents pharmaceutiques influent directement îlots permettra d'améliorer l'efficacité du traitement et de l'aide à la traduction d'un modèle in vivo.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ont rien à révéler.

Remerciements

Nous tenons à remercier Renée L. Pasker et Harpreet K. Brar pour l'assistance technique d'experts sur les protocoles décrits dans ce travail. En outre, nous tenons à remercier le mentorat de Christopher B. Newgard à l'Université Duke et Alan D. Attie à l'Université de Wisconsin-Madison, avec le soutien des membres de leur laboratoire, qui nous ont permis le temps et le soutien nécessaires pour optimiser la protocoles décrits. En particulier, nous remercions Hans Hohmeier, Danhong Lu, et Helena Winfield dans le laboratoire Newgard et Marie Rabaglia dans le laboratoire Attie pour des discussions et des conseils productifs. Ce travail a été soutenu par le NIH DK080845 de subvention et le diabète juvénile 594
Fondation de la recherche subvention 17-2011-608 (MEK)

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase de Clostridium histolyticum convient pour l’isolement des îlots actifsSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Balanced Salt Solution 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (poudre)Invitrogen (Crédit : Gibco)31800-022
Albumine de sérum bovin (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 Fil de suture en soieOutils de science fine18020-30
Dumont #5 PinceOutils de science fine11251-10
Pince de 0,8 mm  ;   ;Outils de science fine11050-10
Ciseaux courbesOutils de science fine14061-10
Vannas-Tü ; Bingen Ciseaux à ressort - Droit/Tranchant/8,5 cm/5 mm TranchantOutils de science fine15003-08
Ciseaux de dissectionOutils de science fine14002-14
5 ml BD Luer-Lok SeringueBD309646
1 ml Seringue BDBD309628
30 G Aiguille BD 1/2 » LongueurBD305106
27 G Aiguille BD 1/2 » LongueurPierre305109
Outils scientifiques fins29008-01
2-2-2-tribromoéthanolSigma-AldrichT48402-25G
2-méthyl-2-butanolSigma-Aldrich240486-100mL
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Chlorure de potassiumSigma-AldrichP3911
Phosphate monopotassique (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Bicarbonate de sodium (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2· ; 2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4· ; 7H2OSigma-AldrichM9397
Pénicilline-StreptomycineInvitrogen (Gibco)15140-122
Sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur (H.I. FBS)Fisher ScientificSH30088.03HI
3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG
à aiguiser BD

Références

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

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