L'analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

Summary

Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d'ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse des microréseaux.

Abstract

Décollement de la rétine (RD) décrit une séparation de la rétine neurosensorielle de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L'EPR est essentiel pour la fonction normale des neurones sensibles à la lumière, les photorécepteurs. Détachement de la rétine de l'EPR crée un espace physique qui est rempli de fluide extracellulaire. RD initie événements indésirables cellulaires et moléculaires qui affectent à la fois la rétine neurosensorielle et l'EPR depuis l'échange physiologique des ions et des métabolites est gravement perturbé. La conséquence de vision est liée à la durée du détachement depuis un réapposition rapide des deux tissus entraîne la restauration de la vision ^1. Le traitement de la RD est exclusivement chirurgical. L'élimination du corps vitré (vitrectomie) est suivie de l'enlèvement partie non essentielle de la rétine autour de la zone individuelle de favoriser un décollement de rétine. Les spécimens rétiniennes enlevées sont res nullius (rien) et, normalement, par conséquent rejetées.Pour récupérer l'ARN à partir de ces prélèvements chirurgicaux, nous avons développé la procédure Journal qui permet la conservation d'ARN pendant le transfert du bloc opératoire au laboratoire. Nous avons également un protocole standardisé pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse de l'expression génique globale. La qualité de l'ARN a été validé à la fois par RT-PCR et l'analyse des microréseaux. L'analyse des données montre une implication simultanée de l'inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs au cours de RD.

Introduction

L'objectif thérapeutique principal de décollement de la rétine (RD) est de trouver un moyen de limiter les dommages aux cellules des photorécepteurs et inflammation de la rétine résultant de la séparation des photorécepteurs à partir des cellules épithéliales pigmentées de la rétine. Au cours de RD, les cellules RPE sont activés, migrer, dédifférencier et prolifèrent à la surface de la rétine décollée, exerçant des forces contractiles conduisant à des complications. Analyse transcriptomique de la RD est un moyen d'identifier les gènes cibles avec une expression modifiée suite RD et donc futures molécules thérapeutiques qui pourraient améliorer le résultat vis....

Protocol

1. Journal: Procédure pour récupérer les échantillons du bloc opératoire

Dans le laboratoire

1. Obtenez un contrat d'importation de la compagnie de livraison express.
2. Remplissez 10 (ou 25) des formulaires d'expédition avec l'adresse postale du laboratoire indiquant la personne de contact dans le laboratoire (numéro de téléphone et adresse e-mail).
3. Préparation 10 (ou 25) des formes d'échantillons numérotés de 1 à 10 (ou 25). Ces formulaires comprennent des espaces dédiés à informer sur a) l'identification anonyme du patient, b) la date de la chirurgie et c) des observations complémentaires le ch....

Results

La procédure Journal (Figure 1) nous permet de récupérer des échantillons de rétine du bloc opératoire à l'ARN purifié, et d'analyser le transcriptome de décollement de la rétine. Résultats de décollement de la rétine dans la régulation positive de la MCP1 chimiotactique des monocytes gène CCL2, et dans la diminution de l'expression de la tige photorécepteur transduction gène GNAT1, le cône ondes courtes opsin OPN1SW, et le homéogène CRX (Figure 2). L.......

Discussion

L'élaboration d'une procédure de recouvrement de tissu du bloc opératoire a été essentielle à l'analyse du transcriptome de décollement de la rétine. Il faut remarquer que ce type de chirurgie est pratiquée en urgence et que les ophtalmologistes exploitation ont peu de temps pour participer à un programme de recherche biologique quand ils opèrent. Cette rétinectomie est également effectuée stochastique dans chaque service, de sorte que le plus simple pour atteindre le nombre statistiques est de travailler av.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Aventi J-E
Rotor	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	LE 80K
Rotor	Beckman Coulter	SW41
Alimentation	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	Fourni avec dispositif d’électrophorèse sur gel d’agarose PT-DA 2105:2
	Biorad	MiniGel Cell GT
Biorad		GelDoc-It Imager
Tube stérile en polyéthylène de 5 ml	Greiner	115261
Tube à centrifuger stérile en polyallomère	Beckman Coulter	331372
Réactifs chimiques	Sigma		Qualité biologie moléculaire (produits sans RNase et DNase)
Solution de nettoyage	VWR	RBS
Puce Microarray	Affymetrix	Human U133 plus 2 array