Application d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps

Résumé

La protéine de liaison à l'ADN des cellules privées (DPS) joue un rôle crucial dans la lutte contre le stress bactérienne. Cet article traite de la purification de l' E. coli Dps et le protocole pour une In vitro Essai démontrant protection Dps médiée par de l'ADN de la dégradation par les espèces réactives de l'oxygène.

Résumé

Le stress oxydatif est un sous-produit inévitable de la vie aérobie. L'oxygène moléculaire est essentielle pour le métabolisme terrestre, mais elle participe également à de nombreuses réactions néfastes au sein des organismes vivants. La combinaison du métabolisme aérobie et de fer, qui est un autre composé essentiel pour la vie, est suffisant pour produire des radicaux grâce à la chimie de Fenton et dégrader les composants cellulaires. dégradation de l'ADN est sans doute le processus le plus dommageable impliquant radicaux intracellulaires, comme la réparation de l'ADN est loin d'être trivial. L'analyse présentée dans cet article propose une technique quantitative de mesurer et de visualiser l'effet des molécules et enzymes sur lésions de l'ADN induites par des radicaux.

L'essai de protection de l'ADN est un outil simple, rapide et robuste pour la caractérisation in vitro des propriétés protectrices de protéines ou de produits chimiques. Elle consiste à exposer l'ADN à une réaction d'oxydation nuisible et en ajoutant des concentrations variables du composé d'intérêt. La réduction ou l'augmentation de l'altération de l'ADN en fonction de la concentration du composé est ensuite visualisées par électrophorèse sur gel. Dans cet article, nous démontrons la technique du test de protection de l'ADN en mesurant les propriétés protectrices de la protéine de liaison d'ADN à partir de cellules privées (DPS). Le DPS est un mini-ferritine qui est utilisé par plus de 300 espèces de bactéries pour lutter puissamment facteurs de stress environnementaux. Ici, nous présentons le protocole de purification Dps et les conditions de dosage optimisé pour évaluer la protection de l'ADN par Dps.

Introduction

Les organismes aérobies doivent constamment composer avec les espèces réactives de l'oxygène qui peuvent endommager leur ADN ainsi que d'autres macromolécules biologiques cruciales. Un outil puissant pour contrer les effets toxiques du stress oxydatif est la protéine de liaison d'ADN à partir de cellules privées (DPS). Depuis sa découverte en 1992 du affamé E. coli culture ^1, Dps a été identifié dans plus de 300 espèces de bactéries et archéobactéries ^2. Régulation à la hausse massive des Dps pendant la phase stationnaire rend la protéine nucleoid associée plus fortement exprimé de E. coli dans des conditions de famine ^{3, 4.} En outre, Dps a été montré pour préserver à la fois la viabilité bactérienne et l'intégrité de l'ADN pendant de nombreuses diverses contraintes, notamment la famine, la concentration élevée en fer, exposition à la lumière UV, le choc thermique, et le stress oxydatif ^{5, 6.}

Structurellement, Dps auto-associés dans un complexe homo-oligomères stable de 12 monomères, which assembler en une coquille creuse sphérique. La cavité interne ~ 4,5 nm à l'échelle est accessible au solvant par des pores qui permettent le passage de petites molécules ⁷ extérieur, et il peut séquestrer les métaux tels que le fer minéralisées ^8. L'effet protecteur de Dps tire de ses différentes activités biochimiques, qui comprennent les liaisons non spécifiques ADN ^1, l'activité ferroxydase et stockage du fer ^8.

Une étude détaillée des activités biochimiques bénéfiques de Dps exige d'abord sa purification. Dps purification est une procédure complexe, comme Dps doivent être séparés non seulement d'autres protéines, mais aussi de tout ADN lié ^7. Notre processus de purification optimisé utilise de nombreuses techniques communes, composé de deux colonnes échangeuses d'ions et une étape de précipitation de sulfate d'ammonium. Plusieurs échanges tampons sont nécessaires, comme Dps très concentrés peuvent précipiter hors de la solution dans de faibles conditions de sel. Une fois la protéine Dps a été purifiée, Il peut être appliqué à des tests qui mesurent directement son activité ferroxydase ^8, stoechiométrie DNA-binding ^9, et les mécanismes de fixation du fer ^10. Dps purifiées a également d'autres applications potentielles. La structure sphérique creuse du Dps a été utilisé comme échafaudage pour stocker des particules hydrophobes à l'intérieur de la cavité de la protéine ¹¹ et même comme une chambre de réaction pour synthétiser de nouveaux nanoparticules magnétiques ^12.

La capacité de protection de Dps à la médiation dommages causés par les espèces réactives de l'oxygène peut être clairement et directement démontré en utilisant le test de protection de l'ADN ^{13, 14.} Dans cette procédure in vitro, les espèces radicalaires sont produites lorsque le fer catalyse H ₂ O _{2 à} la dégradation par la chimie de Fenton. Ces radicaux endommager directement l'ADN présent dans la réaction et peuvent complètement se dégrader à des concentrations élevées. Deux activités DPS clés peuvent aussi contrer directement les effets de Fentla production de radicaux sur-médiatisée. Dps abaisse la concentration en fer catalytique par minéralisation, consommant du peroxyde d'hydrogène disponible dans le procédé. En outre, Dps liaison à l'ADN peut potentiellement protéger physiquement les dommages des radicaux et se condense en un petit volume avec une surface moins réactif. La combinaison de ces deux propriétés rend le dosage de la protection de l'ADN bien adapté dans le but de mesurer l'activité Dps protection.

L'essai de protection de l'ADN est très polyvalent et peut être utilisé pour une variété d'applications au-delà Dps caractérisation. Les dommages des radicaux est une forme courante de stress dans les cellules, et de nombreuses protéines et de produits chimiques sont utilisés pour la contrecarrer. Le principe général de l'épreuve, en utilisant l'intégrité de l'ADN comme marqueur pour les dommages des radicaux, peut être utilisé en combinaison avec presque aucune réaction produisant des radicaux ou agent de contrecarrer. Entre autres, le test a été utilisé avec succès pour déterminer les propriétés anti-oxydantesde K. Extrait paniculata pour une utilisation dans l'industrie alimentaire ^15, pour caractériser les effets de l'acide urique sur les dommages hydroxyle médiation ^16, et d'acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la fourrure de la transcription des protéines de régulation ^17.

Malgré les nombreuses utilisations de l'analyse dans les documents publiés, nous avons constaté que beaucoup d'optimisation et de dépannage sont nécessaires, ce qui rend la mise en place du dosage pour la première fois un processus inutilement laborieux pour de nombreux chercheurs. Le protocole que nous présentons dans cet article vise à supprimer cette barrière à l'entrée.

Protocole

1. Dps Expression et purification

L'obtention d'une protéine de haute pureté est une première étape essentielle pour le dosage de l'ADN-protection. Purification de la protéine Dps peut être réalisée dans 4 à 5 jours.

1. Transformer une souche déficiente en protéase de E. coli (comme BL21 (DE3) pLysS) avec un vecteur pET (tels que pET17) dans lequel la séquence codant pour la protéine Dps a été cloné.
2. Morts les cellules transformées en bouillon sur des plaques d'agar Luria (LB) contenant des antibiotiques appropriés (comme l'ampicilline et le chloramphénicol pour les exemples fournis dans 1.1). Incuber une nuit à 37 ° C.
3. Inoculer une seule colonie de la plaque dans 30 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Incuber une nuit à 37 ° C tout en agitant à 200-250 rpm.
4. Inoculer 2 x 1 de milieu LB L contenant les antibiotiques appropriés avec 10 ml de la culture de la nuit. Croître à 37 ° C, tout en agitant, à ₆₀₀ OD d'environ 0,6. (Culture de cellules à OD augmente le rendement en protéines plus élevée, sans compromettre sensiblement la pureté du produit final.) Induire l'expression de Dps en ajoutant IPTG à une concentration de 0,3 mM, et incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures tout en agitant.
5. Récolte des cellules par centrifugation à 6000 g pendant 15 min. Reprendre les culots de cellules dans 7,5 ml de DEAE tampon A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM EDTA) par litre de culture cellulaire induite. Les échantillons peuvent être congelés dans l'azote liquide et conservés à -80 ° C, si désiré. La procédure peut ensuite être poursuivie par décongélation les échantillons dans un bain d'eau à 4 ° C.
6. Ajouter un mélange d'inhibiteurs de la protéase (tels que les inhibiteurs de protéase ensemble Calbiochem III, à 0,167 pi par ml de suspension cellulaire) à la suspension de cellules à prévenir la dégradation de Dps surexprimés.
7. Préparer extrait acellulaire en utilisant une presse française. Premier de la presse française avec 20 ml de DEAE tampon A (si vous utilisez un modèle à flux continu), puis perturbationst l'échantillon deux fois à 20 kpsi. Centrifuger le lysat à 30.000 g pendant 35 min à 4 ° C pour clarifier des particules insolubles, et récupérer le surnageant. Le surnageant peut ensuite être congelé à l'azote liquide et stockés à -80 ° C, si on le désire.
8. Equilibrer un ml de DEAE Sepharose 30 CL-6B avec DEAE tampon A, en utilisant une FPLC. Exécuter un tampon à travers la colonne de 1-2 ml / min avec une pression maximale de 0,2 MPa-dessus du fond. Charger l'extrait acellulaire sur la colonne, et de commencer à recueillir le flux continu une fois le signal OD ₂₈₀ commence à augmenter au-dessus de base. Laver la colonne avec DEAE tampon A jusqu'à ce que la valeur de DO ₂₈₀ retourne à la normale, tandis que la collecte en permanence le flux continu. Le flux continu devrait contenir la majorité de la protéine Dps, sans trace d'ADN lié. Laver la colonne avec 100% de tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M de NaCl, 0,1 mM EDTA). Cet éluat contient complexes Dps-ADN ainsi que d'autres protéines et peut être jeté.
9. Retirer annoncecontaminant conditionnelle protéines par précipitation au sulfate d'ammonium. Déterminer le volume de mise en commun accréditives. Lentement (pendant une période de 10 à 20 min) ajouter du sulfate d'ammonium petit-grain sec à 62% de saturation (390 mg par ml de solution) à 4 ° C, sous bonne agitation. Agiter le mélange pendant 20 à 30 min de plus un après l'ajout de la dernière partie du sulfate d'ammonium afin d'assurer l'équilibrage complet. Dps restent solubles, tandis que les protéines contaminantes se précipiter hors de la solution.
10. Éliminer les protéines précipitées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C et sauver le surnageant.
11. Lentement, ajouter un 227 mg de sulfate d'ammonium supplémentaire par ml de surnageant pour atteindre 94% de saturation et remuer pendant 20-30 min pour assurer l'équilibrage complet. Dps précipités à cette concentration élevée en sel et peuvent être collectées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Dps seront dans le culot, le surnageant peut être jeté. Le culot peut être conservé à -80 ° C si desIRED.
12. Reprendre le Dps culot contenant en Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1 mM EDTA). Réglez le volume de l'échantillon à 2,5 ml.
13. Échange tampon pour éliminer le sulfate d'ammonium en utilisant une colonne de filtration sur gel PD-10. Equilibrer le lit de gel avec 25 ml Resuspension Buffer. Appliquer le 2,5 ml de Dps échantillon au sommet de la colonne PD-10 et laisser tremper po Jeter l'effluent à travers. Recueillir Dps en éluant avec 3,5 ml Resuspension Buffer.
14. Centrifuger l'échantillon de tampon échangé à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les composants insolubles et diluer avec 6-10 ml de tampon de dilution (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) pour s'assurer que le concentration en sel est suffisamment faible pour Dps de se lier à la colonne de Sepharose SP. Échantillons particulièrement concentrées de Dps peuvent devenir moins soluble lors de la dilution dans un tampon inférieur sel, comme en témoigne trouble du liquide, mais peuvent être complètement resolubilisé par l'ajout d'un petit Amount de 5 solution de NaCl M (un 10-20 mm supplémentaire).
15. Equilibrer une colonne de 30 ml SP Sepharose Fast Flow avec SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,1 mM EDTA). Exécuter un tampon à travers la colonne à 1,5-2 ml / min avec une limite de pression de 0,3 MPa-dessus du fond. Charger l'échantillon sur la colonne. Laver avec SP tampon A jusqu'à ce que la DO ₂₈₀ déclarations de traces à l'état initial, et jeter le accréditives. Exécuter un gradient linéaire de 150 ml de 0 à 100% de tampon B, tout en collectant des fractions de 2 ml. PDD élution dans un pic aigu à environ 50% de B, si variation de 10% est possible.
16. Exécutez les fractions d'élution sur un gel à 15% SDS-PAGE, et vérifier la contamination de l'ADN en mesurant le rapport DO ₂₆₀ / DO ₂₈₀ à l'aide d'un spectrophotomètre. Le gel ne doit montrer une bande autour de 19 kDa, et la DO ₂₆₀ / DO ₂₈₀ est généralement autour de 0,7. Piscine fractions les plus pures dps. Utilisez un filtre centrifuge (comme l'unité de filtration Ultra Amicon) avec un10K poids moléculaire de coupure de concentrer les Dps et échanger dans un tampon de stockage (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM). Aliquote les Dps purifiés, et congeler dans l'azote liquide pour le stockage à -80 ° C.

2. Essai de protection de l'ADN

Le test implique plusieurs étapes sensibles au facteur temps et doit être chronométré à la seconde pour obtenir des résultats reproductibles. Beaucoup d'ingrédients et les étapes de pipetage sont impliqués, donc une table de pipetage (voir tableau 1) est conseillé de garder une trace des étapes et des volumes. Le temps total nécessaire pour le dosage est de pas plus de 3 heures.

1. Mesurer 30 ml d'eau dans un flacon étanche à l'air; rincer l'eau avec du N ₂ pendant 10 minutes (à l'aide de deux aiguilles de seringue, une dans le fluide, l'une au-dessus de celle-ci) pour éliminer l'oxygène de la solution. Ajouter 0.0168 g _FeSO4 • 7H ₂ O à l'eau pour obtenir une solution mère de 2 mm. Sceller le flacon et rincer avec de l'azote pendant 5 minutes de plus, puis mélanger. La solution doit êtreclair, si tout soupçon de jaune est détectable, préparer une nouvelle solution de fer.
2. Faire une solution 100 mM H ₂ O ₂ (10,87 pi de 9.2MH ₂ O ₂ dans 1 ml d'eau); garder sur la glace et à l'abri de la lumière en l'enveloppant dans du papier d'aluminium. Utilisez uniquement pendant environ 1-2 heures après la préparation raison de la désintégration spontanée. Le stock de peroxyde d'hydrogène est également soumis à une panne, qui peut être partiellement atténué par un stockage approprié (dans l'obscurité, à 4 ° C). Des contrôles réguliers de la concentration des actions en mesurant les ₂₄₀ OD sont recommandés.
3. Dégeler une aliquote de Dps purifiée rapidement dans un bain d'eau à température ambiante et garder sur la glace. Centrifuger pendant 10 secondes à 4000 g dans une table picocentrifuge aux agrégats de précipité. Mesurer la concentration après centrifugation à l'aide d'un spectrophotomètre (DO ₂₈₀ = 1,547 indique une concentration de 100 Dps monomères pM).
4. Diluer l'ADN linéaire à partir du stock de haute concentration en utilisant 12x tampon de réaction (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) à une concentration de 100 ng / ul. ADN linéaire est utilisée pour rendre plus facile la quantification, mais l'ADN plasmidique peut être utilisé aussi bien.
5. 1 ul du mélange ADN-tampon dans un tube PCR. Ajouter suffisamment d'eau dans le mélange réactionnel de telle sorte que le volume final de la réaction (moins SDS) sera de 12 ul. Ce montant doit être calculé à l'avance en utilisant le tableau de pipetage. Ajouter Dps à une concentration de dodécamère finale de 3 um. Incuber pendant 15 min à température ambiante pour permettre Dps de se lier à l'ADN.
6. Ajouter suffisamment de solution à 2 mM _FeSO4 pour atteindre la concentration souhaitée. Une expérience typique utilise une gamme de concentrations de 0 à 1 mM _FeSO4. Des concentrations plus élevées provoqueront plus grande dégradation de l'ADN mais peuvent également conduire à la formation de fer précipite dans le mélange réactionnel. Rapidement ajouter 1 pl de la solution à 100 mm H ₂ O ₂ (à une concentration finale de 10 mM), et incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre à l'FentonMédiée par réaction de dégradation à prendre place.
7. Ajouter 0,8 l de 20% de SDS (dodécylsulfate de sodium). Mélanger et incuber à 85 ° C pendant 5 min à perturber les complexes Dps-ADN. Le SDS déstabilise le complexe Dps-ADN et empêche des changements de gel indésirables pour l'ADN, ce qui améliore la facilité de quantification. Une étape facultative consiste à arrêter la réaction par voie catalytique dégradant le peroxyde d'hydrogène en produits non toxiques. Pour les conditions décrites dans le présent protocole, cette étape n'est pas nécessaire d'obtenir un large éventail de dégradation de l'ADN.
8. Incuber sur de la glace pendant 1 min, ajouter le colorant de charge, et charger sur un gel d'agarose. Exécutez le gel, et tacher de l'ADN en utilisant le bromure d'éthidium. Le gel doit être teinté post-électrophorèse plutôt qu'avant électrophorèse, pour empêcher le SDS d'interférer avec la distribution de bromure d'éthidium dans le gel.

Résultats

Le procédé de purification pour Dps décrits ici est très reproductible. Dps purification selon le protocole décrit, en utilisant 2 L de E. culture coli comme point de départ, va typiquement donner 2,5 ml de protéine contenant Dps ₁₂ à des concentrations comprises entre 5 et 12 um. Temps d'induction plus longue (4 heures) semblent réduire cette variabilité. la pureté des protéines est constamment au-dessus de 99%, comme en témoignent les gels SDS-PAGE (Figure 1). Le nivea...

Discussion

Le procédé de purification de Dps comme décrit dans cet article est très robuste. Pureté a toujours été élevé (> 99%); pas d'autres protéines apparaissent sur gels SDS-PAGE que des bandes visibles. Malgré cela, certains lots de Dps purifiés semblent avoir une activité nucléase, comme en témoigne la dégradation de l'ADN partielle lorsqu'ils sont incubés avec des concentrations très élevées de Dps. Cela pourrait indiquer la présence d'DNases très actifs à faible concentration que nous n'avons pas pu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BL21(DE3)pLysS cellules compétentes	Promega	L1195
pET-17b ADN	EMD-Millipore	69663-3
LB bouillon en poudre	Sigma-Aldrich	L3022
Ampicilline sel sodique	Sigma-Aldrich	A0166
Chloramphénicol	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
Hydroxyde de potassium	Merck	105033
Chlorure de sodium	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Cocktail d’inhibiteur de protéase Set III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	Sigma-Aldrich	DFF100
Sulfate d’ammonium	Sigma-Aldrich	A4418
-10 Colonnes de dessalage	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra Centr. Filtre (10K MWCO)	Millipore	UFC901024
Sulfate ferreux heptahydraté	Sigma-Aldrich	F8048
Solution de peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
Solution SDS	Bio-Rad	161-0418
Bromure d’éthidium	Sigma-Aldrich	E1510
Incubateur statique	Hettich	INE500
Incubateur à secousses	Nouveau-Brunswick Sc.	Inova 44
Centrifugeuse refroidie	Beckman Coulter	Avanti J-E
Centrifugeuse de table	Eppendorf	5424
Disrupteur de cellules	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA/AA
FPLC Purificateur	General Electric	AKTA
Flacons hermétiques	Cole-Parmer	EW-08918-85
Aiguilles pour seringues	BD	305128
Pipettes	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA