Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Résumé

Cet article se concentre sur l'identification des ensembles de données d'interaction de haut confiantes entre l'hôte et les protéines pathogènes en utilisant une combinaison des deux méthodes orthogonales: deux hybrides de levure suivie d'un test d'interaction à haut débit dans les cellules de mammifères appelé HT-ACPG.

Résumé

Des efforts importants ont été recueillies pour produire des cartes réseau interactions à grande échelle globale protéine-protéine. Cela est essentiel à comprendre les relations pathogène-hôte et a été essentiellement réalisée par des projections génétiques dans la levure de systèmes à deux hybrides. La récente amélioration de la détection des interactions protéine-protéine par un test de complémentation de fragment luciférase basé Gaussia offre maintenant la possibilité de développer des approches interactomic comparatives d'intégration nécessaires pour comparer rigoureusement les profils d'interaction des protéines de différentes variantes de la souche pathogène contre un ensemble commun de facteurs cellulaires.

Ce document se concentre spécifiquement sur ​​l'utilité de la combinaison de deux méthodes orthogonaux pour générer des ensembles de données d'interaction protéine-protéine: deux hybrides de levure (Y2H) et un nouveau test, test à haut débit Gaussia princeps protéines complémentation (HT-ACPG) réalisée dans les cellules de mammifères. nt "> Une identification à grande échelle des partenaires cellulaires d'une protéine pathogène est effectuée par base de levure accouplement projections de deux hybrides de banques d'ADNc en utilisant de multiples variantes de souches de pathogènes. Un sous-ensemble de partenaires d'interaction sélectionnés sur un score de haute fiabilité statistique est plus validé dans les cellules de mammifères pour les interactions par paire avec l'ensemble des agents pathogènes les protéines variantes utilisant HT-ACPG. Cette combinaison de deux méthodes complémentaires améliore la robustesse de l'ensemble de données d'interaction, et permet l'exécution d'une analyse de l'interaction comparatifs rigoureux. Ces interactomique comparatifs constituer une stratégie fiable et puissant pour décrypter toute les imbrications pathogène-hôte.

Introduction

La quantité croissante de données recueillies pour produire des cartes d'interaction protéine-protéine ouvre des perspectives pour mieux comprendre les infections pathogènes. Comme compréhension globale des infections pathogènes commence à émerger, il donne accès à la gamme des perturbations induites par les protéines pathogènes lors de la connexion du protéome humain ^1. Il offre ainsi un moyen de comprendre comment les agents pathogènes manipuler la machinerie de la cellule hôte. En particulier, la cartographie de plusieurs réseaux d'interactions virus-hôte a révélé que les protéines virales cibler préférentiellement les protéines hôtes qui sont f....

Protocole

1. Levures Examens double-hybride

1. Faire les solutions requises suivantes:
   1. Complete Out Drop synthétique (SD): dissoudre 26,7 g de la base minimale SD avec du glucose dans 1 litre d'eau. Ajouter 2 g de mélange d'acide aminé préparée comme suit: 2 g hemisulfate Adénine, 2 HCl arginine g, 2 HCl histidine g, 2 g Isoleucine, 4 g de leucine, 2 HCl lysine g, 2 g de méthionine, 3 g phénylalanine, 2 g L -sérine, 2 g de L-thréonine, le tryptophane 3 g, 2 g Tyrosine, 1,2 g uracile, 9 g de valine.
   2. Baisse sélective Out SD-L/-W/-H: SD contenant tous les acides aminés essentiels, sauf celles sp....

Résultats

Une des grandes forces de HT-ACPG réside dans sa sensibilité élevée, comme en témoigne l'évaluation des taux négatifs faux positifs et faux pour la protéine E2 du VPH dans la figure 2 (adapté de la référence 13). Pour déterminer le taux de faux négatifs, les interactions connues de E2 de HPV16 ont été évalués par HT-ACPG (figure 2A). Quatre des 18 interactions n'ont pas été récupérés (correspondant à un taux de faux négatifs de 22%). Les interactions faux positifs ont été mesuré.......

Discussion

Indépendamment, la levure deux essais d'interaction hybrides et les mammifères, comme la TPS déroulant, LUMIER ou MAPPIT, se sont avérés être des outils efficaces pour détecter les interactions protéine-protéine, mais sont limitées par le taux élevé de faux positifs et de faux négatifs interactions associés à ces techniques ^15. En outre, les preuves sont de plus en plus que la combinaison de méthodes orthogonales augmente la fiabilité de l'ensemble de données d'interaction obtenu ^7. Le .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souches de levure	Clontech
Minimal SD base	US biologique	D9500
Acides aminés	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Sérum fœtal bovin	BioWest	S1810
Tampon phosphate salin (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Pénicilline-Streptomycine	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsine-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase	test Promega	E2820
Blanc plaque de culture	Greiner Bio-One	655083
96-wellPlaques PCR	4titude	4t-i0730/C
Incubateur (30 ° ; C)	Incubateur Memmert
(37 ° ; C)	Luminomètre Heraeus
	Berthold	Centro XS-LB 960