Utilisation d&#39;<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie à suivre la progression de cytomégalovirus souris une infection expérimentale chez les prématurés

Résumé

Le cytomégalovirus (HCMV) infection humaine des nouveau-nés représentent une cause importante de déficience mentale, mais les événements moléculaires conduisant à la pathogenèse induite par le virus sont encore mal compris. Pour étudier la dynamique de l'infection du cerveau, nous avons adapté animal entier In vivo Imagerie d'effectuer une analyse temps-cours des nouveau-nés infectés par un virus recombinant luciférase.

Résumé

Cytomégalovirus humain (HCMV ou HHV-5) est un agent pathogène mortelle, chez les personnes immunodéprimées. Lors de l'infection congénitale ou néonatale, le virus peut infecter et de se répliquer dans le développement du cerveau, ce qui peut induire des lésions neurologiques graves, y compris la surdité et le retard mental. En dépit de la gravité potentielle des symptômes, les options thérapeutiques sont limitées par l'absence d'un vaccin et l'absence d'un traitement antiviral spécifique. En outre, une description précise des événements moléculaires qui se produisent au cours de l'infection du système nerveux central (SNC) fait encore défaut depuis observations proviennent principalement de l'autopsie des enfants infectés. Plusieurs modèles animaux, comme les macaques rhésus CMV, ont été mis au point et fourni des indications importantes sur la pathogenèse CMV dans le SNC. Cependant, en dépit de sa proximité avec l'évolution des humains, ce modèle a été limitée par la procédure d'inoculation intracrânienne utilisé pour infecter les animaux et les inconvénientsistently induire une infection du système nerveux central. En outre, les considérations éthiques ont favorisé le développement de modèles alternatifs, parmi lesquels l'infection néonatale de souriceaux nouveau-nés par le cytomégalovirus de la souris (MCMV) a récemment permis des avancées significatives. Par exemple, il a été signalé que l'injection intrapéritonéale de MCMV à Balb / c nouveau-nés conduit à l'infection de neurones et les cellules gliales dans des zones spécifiques du cerveau. Ces résultats suggèrent que l'inoculation expérimentale de souris pourrait récapituler les déficits induits par l'infection à CMV chez les enfants. Néanmoins, une analyse dynamique de l'infection par MCMV des nouveau-nés est difficile à réaliser parce que la méthode classique nécessite le sacrifice d'un nombre important d'animaux à différents points dans le temps d'analyser la charge virale et / ou les paramètres liés au système immunitaire. Pour contourner cet obstacle et permettre futures enquêtes sur les animaux mutants rares, nous avons appliqué la technologie d'imagerie in vivo pour effectuer une analyse temps-courant de l'viraL diffusion dans le cerveau lors de l'injection périphérique d'une MCMV recombinant exprimant la luciférase de C57BL / 6 nouveau-nés.

Introduction

Cytomégalovirus humain (HCMV/HHV-5) est un membre de la famille β-herpesvirus. HCMV est très répandue, pathogène opportuniste qui est généralement acquise en début de vie comme une infection asymptomatique ^1. Comme tous les virus de l'herpès, HCMV persiste pendant toute la vie de l'hôte dont le système immunitaire contrôle étroitement la réplication virale. Les épisodes de réactivation virale surviennent surtout chez les personnes immunodéprimées comme les patients transplantés recevant des médicaments pour prévenir le rejet du greffon ^2. Chez les adultes, HCMV a également été liée à glioblastomes ^3. En outre, HCMV est un agen....

Protocole

1. Préparation de la suspension virale

1. Obtenir la souche Smith de MCMV exprimant la luciférase (MCMV-Luc ¹⁵⁾ du laboratoire de Ulrich Koszninowski. Dans ce recombinant, le gène de la luciférase est insérée dans le locus du génome IE2 MCMV.
2. Pour amplifier MCMV-Luc, infecter une lignée murine de la moelle osseuse des cellules stromales (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) avec MCMV à différents multiplicité d'infection (MOI, 0,001 à 1) ^16. Pour ce faire, ajoutez le virus à des cellules cultivées dans un milieu sans sérum à 37 ° C. Après une heure, retirer le surnageant et le remplacer par du DMEM complété avec du sérum de v....

Résultats

Une expérience représentative est illustrée à la figure 1. Lors de l'injection intrapéritonéale de 50 PFU de MCMV-Luc (groupe A montre une injection similaire menée au bleu de méthylène pour visualiser la voie sous-cutanée de l'aiguille), les nouveau-nés ont été anesthésiés et reçues simultanément 0,3 mg du substrat luciférase (Luciferin, Caliper). Quinze minutes plus tard, les animaux ont été placés face ventrale dans la chambre de l'acquisition de la SIIV 50 (système d'imagerie in vivo.......

Discussion

En utilisant la technologie d'imagerie in vivo pour surveiller MCMV-Luc diffusion chez la souris nouveau-nés, nous avons pu observer la propagation du virus dans le cerveau des animaux mutants, par opposition au type sauvage. En outre dissection de l'animal et de l'imagerie ex vivo du cerveau a confirmé la présence du virus de luminescence dans le système nerveux central. En outre, nous avons également procédé à l'immunohistochimie (non représenté) sur coupes fines cerveau avec.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif/Matériel
DMEM	Fisher Scientific	W3523A
Methylen blue	Sigma Aldrich	319112
Aiguilles à insuline	VWR	613-4897
Kétamine	CentraVet	Ket 201
Xylazine/Vetranal	Sigma Aldrich	46995
DPBS	DUTSCHER	P0436500
Luciferin	Caliper	760504
gentamycine	Sigma Aldrich	G1272
pénicilline/streptomycine	Gibco	15070
carboxyméthylcellulose	Sigma Aldrich	C4888
formaldéhyde	Sigma Aldrich	F8775
cristal violet	Sigma Aldrich	C3886
Equipment
IVIS 50	Caliper/Perkin Elmer