Manipulation génétique de la souris en développement à travers l'hypothalamus In utero Électroporation

Résumé

Malgré l'importance fonctionnelle et médicale de l'hypothalamus, In utero Manipulation génétique de son développement a été tentée rarement. Nous montrons une procédure détaillée pour In utero Électroporation dans l'hypothalamus de souris et affichent des résultats représentatifs de totale et partielle (régional) transfection hypothalamique.

Résumé

La modification génétique des régions spécifiques du cerveau des mammifères en développement est une approche expérimentale très puissant. Cependant, générant des nouveaux mutants de souris est souvent d'une lenteur décourageante. Il a été démontré que l'accès au cerveau de souris en développement in utero à la survie post-opératoire raisonnable est possible. Pourtant, les résultats de cette procédure ont été signalés presque exclusivement pour la partie la plus superficielle et facilement accessibles du cerveau en développement, à savoir le cortex. Le thalamus, une région étroite et plus médial, s'est avéré plus difficile à cibler. Transfection dans des noyaux plus profond, en particulier ceux de l'hypothalamus, est peut-être les résultats les plus difficiles et donc très peu ont été rapportés. Ici, nous démontrons une procédure de cibler l'ensemble neuroépithélium hypothalamique ou une partie de celui-ci (régions hypothalamiques) pour la transfection par électroporation. Les clés de notre approche sont plus narcose fois, l'injection dans le troisi ventricule, et le type et le positionnement des électrodes approprié. En outre, nous montrons les résultats de ciblage et d'analyse histologique du noyau hypothalamique plus en retrait, le corps mamillaire.

Introduction

La manipulation génétique du cerveau embryonnaire de souris est une approche privilégiée pour en apprendre davantage sur la régulation du développement. La génération de lignées de souris mutantes est cependant lent et coûteux. Une méthode puissante pour introduire des modifications génétiques spécifiques dans le développement des neurones du cerveau des mammifères est en électroporation in utero. Essentiellement, la technique consiste à transfecter l'ADN dans le neuroépithélium cerveau embryonnaire au moyen d'impulsions électriques, puis permettre à l'embryon de survivre pendant un certain laps de temps, de recueillir le cerveau et les ....

Protocole

1. Préparation de l'ADN et verre Micropipettes pour injection

1. Bonne Pipette en verre de qualité sont essentiels pour réduire le taux élevé d'avortements initiale due à la perte de liquide amniotique. La procédure de tirer micropipettes de verre a été bien documenté ^13,18,25. Utiliser 1,2 mm de diamètre capillaires tirée dans une Sutter classique P-97 appareil avec les paramètres P = 500; chaleur = 300; Tirer = 40; Velocity = 50; Temps = 50. Monter l'extracteur avec 3 mm de filaments de «creux» (Sutter Instrument FT330B). Les filaments de taille de 2 mm ont donné pour nous des résultats moins satisfaisants. D'autre part, le biseau....

Résultats

La plupart des neurones de l'hypothalamus sont nés entre E11.5 à E15.2, selon l'analyse naissance-dating chez le rat ²⁶ traduit en développement un peu plus courte de souris ^27,28. Le pic de la neurogenèse hypothalamique est atteint à E12.5 ^29-31. En conséquence, à l'âge de transfection choisi pour la présente étude (E12.5), une grande proportion des neurones hypothalamiques peut être marqué à n'importe quel niveau rostro-caudale donné.

Analyse à -18,5 en sec.......

Discussion

A propos de l'anesthésie: Depuis électroporation in utero dans l'hypothalamus peut être techniquement difficile et nécessiter des temps de narcose plus, nous préférons pour induire et maintenir une anesthésie par administration d'un mélange d'oxygène et d'isoflurane. Dans notre expérience, les animaux peuvent rester suffisamment anesthésiés de cette façon pendant des périodes allant jusqu'à une heure au moins, la reprise de la mère est très rapide, et la survie de l'embryon améliorée.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
;			FORTS
>Acépromazine	Sanofi GmbH		anesthésique
Isoflurane	Baxter	HDG9623	anesthésique
Ketamin	Pharma GmbH		anesthésique
Fast Green	Fluka	44715	;
Rimadyl	Pfizer		anti-inflammatoire non stéroïdien
Braunoderm	Braun	3887138	povidone-iode
Tampon phosphate Saline PBS	Gibco	14190	;
Temgesic (buprénorphine)	Essex Pharma		analgésique opioïde
Pommade oculaire	Pan-Ophtal	7136926	;
Xylazine	Bayer		;
;			EQUIPMENT
Dispositif d’anesthésie Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia ACN	004 903 682	;
Extracteur capillaire P-97	Sutter Instrument Co.	P-97	;
Compresstome	Instr. de précision	VF-300	Appareil de type vibratome
Microscope confocal	Zeiss	LSM700	;
Cryostat	Leica	CM3050S	;
Électroporateur	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
Électrode 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	Électrode aiguille en acier inoxydable, pointe de 10 mm, diam. 0,5 mm
Électrode 2	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY700P4L	Couvercle Rond Plaque de platine 4 mm de diamètre
Source de lumière froide à fibre optique	Leica	KL2500 LCD	;
Capillaires en verre	Harvard Apparatus	GC120T-15	1,2 mm OD x 0,94 mm ID.
Stérilisateur à billes de verre	Fine Science Tools	FST250	;
Coussin chauffant	Harvard Apparatus	py872-5272	;
Dispositif d’injection	World Precision Instruments	Pompe pneumatique Pico PV820	;
Fil de suture enduit Vicryl	Ethicon	V4914	Suture péritonéale
Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Suture cutanée