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Article de méthode

La barre stabilisatrice: Administration de l'alcool à mouches

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DOI :

10.3791/50442

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18 mai 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Science, Florida State University, 2Department of Biology and Biochemistry, Biology of Behavior Institute, University of Houston

Dans cet article

Résumé

Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.

Résumé

Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l'alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L'alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d'alcool saturé est mélangé avec l'air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l'expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d'alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l'heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d'une analyse de variance. La dernière méthode est d'analyser l'ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.

Introduction

Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l'alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l'exposition initiale à de faibles concentrations d'alcool, les mouches augmentation de l'activité locomotrice d'exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l'activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l'exposition à l'alcool progresse 4-9. L'horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l'alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l'horloge circadienne module sensibilité aiguë à l'alcool mais pas tolérance à l'alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l'espaceet l'expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L'utilisation de la drosophile comme un outil d'enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l'alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d'administration de l'alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l'alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l'administration d'alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d'administration d'alcool approprié pour l'évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation.

Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d'éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d'air sont à barboter dans l'eau et l'alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d'alcool en utilisant la livraison d'alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d'analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.

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Protocole

1. Assemblée de la barre stabilisatrice

Justification et vue d'ensemble: Le système est conçu pour administrer des pourcentages contrôlées de vapeur d'alcool aux mouches. Remarque: La figure 1 donne un aperçu schématique de la barre stabilisatrice mis en place comme décrit ci-dessous en trois étapes (assemblage de l'écoulement de l'air, mise en place de l'alcool et des bouteilles d'eau, et l'assemblage des flacons d'observation). En bref, un flux d'air constant est divisé en deux fractions qui sont gondolées par l'alcool et de l'eau, respectivement, mélangés, et administrés à 4 flacons d'observation.

  1. Assemblée de l'Airflow
    1. Connecter un court morceau de tuyau souple en silicone, soit à l'air d'un bâtiment ou d'un aérateur d'aquarium pour générer un écoulement d'air uniforme et fendu à l'aide d'un raccord en Y. Connecter la première branche au régulateur de débit d'air qui commande la quantité totale d'air à travers le système (généralement 1000 ml / min pendant 4 fioles d'observation).
    2. Insérer un raccord rapide dans le deuxième tubede sorte que le courant d'air peut être interrompu au début de l'expérience, sans affecter l'écoulement d'air calibré. Ajouter un raccord en Y et relier chaque tube de dérivation vers le régulateur de débit d'air.
    3. Relier les tubes pour les régulateurs de débit d'air, puis relier deux mètres de débit d'air.
  2. Mise en place des bouteilles d'alcool et de l'eau
    1. Ajouter tube flexible à la sortie des compteurs de débit d'air et d'insérer un tube en verre mince (sections de pipettes 1 ml) en verre avec un coude à 90 ° dans l'extrémité de chaque longueur de tube. Ce sera le débit d'air d'admission dans les bouteilles d'eau et d'alcool.
    2. Placer des bouchons en caoutchouc avec 2 trous à travers eux dans les bouteilles remplies avec de l'alcool et de l'eau. Gardez les deux bouteilles à une température constante de 2 ° C supérieure à la température de l'air ambiant en utilisant un bain d'eau. Dans nos expériences, la chambre de l'environnement est maintenu à 25 ° C, tandis que le bain d'eau est à 27 ° C.
    3. Insérer la pipette de verre droit pour la uneir entrée à travers le bouchon de caoutchouc et s'étendent dans le liquide jusqu'à environ 1 cm du fond de la bouteille.
    4. Insérer une section de coude de la pipette de verre dans l'autre trou dans le bouchon de caoutchouc jusqu'à ce que l'extrémité du verre soit de niveau avec le fond du bouchon dans la bouteille. Insérer cette sortie d'air dans une autre longueur de tube.
    5. Réunir les courants d'air au moyen d'un raccord en Y et en utilisant une autre longueur de tube en silicone pour diriger le flux d'air à travers un mélange flacon ou une bouteille vide avec des sections de pipette de verre courbés insérés à travers un bouchon en caoutchouc à deux trous. Utilisez une autre longueur de tube de silicone pour le flux d'air mixte sortie.
  3. Assemblée de l'Observation Vial
    1. Diviser le courant d'air d'évacuation sortant de la fiole de mélange 2 à 3 fois pour obtenir 4 ou 8 petits courants d'air de sorte que de multiples flacons d'observation peuvent être utilisées dans chaque expérience. Raccordez le tube de silicone souple pour les flacons d'observation.
    2. Mettre en place la observatisur des flacons en utilisant des flacons vides fermés par un bouchon en caoutchouc comportant deux trous à travers lesquels des tubes de verre fournissent une entrée et une sortie pour la vapeur d'alcool.
    3. Couvrir la fin du premier tube de verre avec un filet et garder le filet en place à l'aide d'un petit morceau de tube en plastique souple. Insérer ce tube à travers le premier trou jusqu'à ce qu'elle s'étende à peu près la moitié de la longueur du flacon. Si nécessaire, utilisez du ruban téflon pour obtenir un ajustement parfait.
    4. Insérer le second tube de verre également avec l'extrémité couverte par le filet jusqu'à ce qu'il soit de niveau avec le bord intérieur du bouchon de caoutchouc.
    5. Placer les flacons horizontalement sur une feuille de papier blanc pour maximiser le contraste avec les mouches dans des conditions de faible lumière rouge.
    6. Mélanger fractions appropriées du flux d'air à barboter dans l'alcool et le flux d'air à barboter dans l'eau. Surveillance de la pression de l'air en continu et faire les ajustements nécessaires pour maintenir le mélange souhaité des courants d'air.
      Remarque: Le fonctionnement continude plusieurs essais Fly Bar en parallèle ou même un seul essai dans une petite pièce peut conduire à une accumulation notable de vapeur d'alcool. Pour éviter la libération continue de la vapeur d'alcool qui peuvent potentiellement affecter le chercheur dans une pièce fermée, un système approprié doit être mis en place qui permet d'éliminer convenablement la vapeur d'alcool généré au cours de l'expérience. Pour éliminer les vapeurs d'alcool, connecter un morceau de tuyau 6-12 pouces sur le second tube de verre en saillie de chaque flacon, les regrouper et ordonner à un système d'entonnoir vide. Les chercheurs doivent aussi veiller à ce que la salle d'essai expérimental est correctement ventilée.

2. Préparation des animaux d'expérimentation

Justification et aperçu: culture et de logements de vol appropriée permettra de réduire la variabilité des données. Ce résultat est obtenu grâce à la standardisation et la réduction du stress vécu par les mouches. Pour cette raison, aucune anesthésie (CO 2 ou alternatives) est utilisé During quelconque des étapes suivantes du protocole. En outre, les mouches doivent être appariés pour l'âge à travers des expériences et des points de temps pour minimiser la variabilité comme c'est la norme pour d'autres analyses comportementales, y compris l'apprentissage et de la mémoire des expériences 17.

La lumière différente: l'obscurité peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l'horloge circadienne dans la réponse comportementale à l'éthanol. Pour déterminer si un rythme diurne existe, les expériences peuvent être effectuées en vertu d'un cycle de LD définis pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). ZT 0 représente l'aube et est défini comme le temps de lumières sous cycles LD, alors que ZT 12, les feux sont éteints temps avec un cycle de LD 12:12 h. Dans des conditions constantes, le temps circadien (CT) mesure le temps pour l'animal en l'absence de signaux de l'environnement, c'est à dire le temps de roue libre, et est liée au cycle LD d'entraînement précédente. Dans de type sauvage drosophile, CT reflète la ZT précédente pour la première de plusieurs jourss dans des conditions constantes que la période circadienne roue libre et les rythmes sont ~ 24 h. Pour mesurer la modulation circadienne et d'éliminer les effets de lumière aiguë sur le comportement, les mouches sont entraînées à la lumière: cycles sombres et ensuite transférés à l'obscurité constante (DD) avant les expériences. Expériences circadiens sont effectuées sur la deuxième journée de DD pour mesurer la performance à circadien temps spécifique (CT).

Chez la drosophile, la lumière continue (LL) conditions entraînent un dysfonctionnement circadien avec des oscillations moléculaires mouillées ou supprimés de base gènes circadiens et la perturbation des rythmes circadiens de comportement, comme en témoigne l'activité locomotrice arythmique 18-21 et arythmique mémoire à court terme 17. Le protocole est optimisée pour les études circadiens et peut être simplifié pour d'autres expériences. Toutes les expériences circadiens sont effectuées avec lumière tamisée rouge (lumière rouge de tête ambiante <1 lux au-dessus de banc, les petites lumières rouges utilisé à 12 pouces de tubes~ 1 lux de lumière).

  1. Arrière vol à 25 ° C sous 12h12 h lumière: conditions d'entraînement sombres (LD).
  2. Recueillir les mouches fraîchement éclos à la fin de la période de lumière du jour le jour 1 et les stocker pendant 24 heures dans des conditions de LD en tenant flacons contenant une petite quantité d'aliments riches en concentration agar pour minimiser la viscosité des aliments. Remarque: Pour assurer la santé, vol normalement développés sont collectées, utilisez uniquement des mouches capturées dans les premiers jours après l'éclosion commence dans un flacon de culture.
  3. Recueillir des lots d'environ 30 (25-35) vole en utilisant un aspirateur le jour 2 vers la fin de la période de lumière, et le transfert des flacons de maintien frais.
  4. Utilisez une forte source de lumière pour diriger vol à l'extrémité du flacon. Dans cette gamme, le nombre exact de vol dans chaque flacon n'est pas critique tant que les observations comportementales sont rapportés en pourcentages en nombre total de mouches comptées à la fin de chaque expérience.
  5. Maintenir vol dans des conditions DD à 25 ° C for deux jours.
  6. Le jour de l'expérience, toutes les mouches placer logés dans des conditions différentes ou d'autres incubateurs de la salle de comportement expérimental dans la chambre pendant au moins 1 heure avant l'expérience. Acclimatation réduit la variabilité due aux changements de température ou d'humidité.
  7. Faire des observations à six points de temps par jour (CT 1, 5, 9, 13, 17 et 21) afin de tester pour la modulation circadienne de comportement.
  8. Comparez plusieurs points dans le temps au sein d'un ensemble unique d'expériences comportementales pour augmenter la robustesse de la conception expérimentale et de minimiser la variabilité spécifique à une seule expérience. Par exemple, les observations de CT 1 et CT 13 peuvent être obtenues simultanément si deux incubateurs avec des horaires clair-obscur opposés sont utilisés pour l'entraînement.
    Remarque: Le procédé ci-dessus décrit la préparation d'animaux de laboratoire pour des dosages effectués en état circadien d'obscurité constante. Différents lumière: conditions sombres peuvent être utilisés pour sonder la fonction de l'horlogedans les réponses comportementales à l'alcool. Pour déterminer si un rythme diurne existe les expériences peuvent être réalisées en vertu d'un cycle de LD pour mesurer la performance à Zeitgeber temps spécifique (ZT). En outre, le protocole peut être utilisé avec des mouches élevés dans des conditions de lumière constante pour la vérification des expériences dysfonction circadien. Pour les protocoles alternatifs qui testent vol logés dans des conditions de lumière, tests comportementaux doivent encore être effectuées dans des conditions sombres. Les mouches doivent être transférés dans l'obscurité pendant 1 heure avant l'expérience pour minimiser la variabilité du comportement dû aux effets aigus de la lumière sur le comportement.

3. Observations comportementales

Justification et aperçu: Le protocole d'administration d'alcool suivante est optimisé pour observations sous condition de faible lumière rouge. Les deux mesures comportementales Lorr et sédation représentent deux points distincts de mouche ivresse. Lorr représente un point fin d'ébriété incorporant la perte omoteur de f et le contrôle postural, tandis que les mesures de sédation un point final très tardif de l'intoxication. Génotype ou modulation circadienne peuvent affecter ces deux mesures différentes; donc on peut souhaiter examiner à la fois. En bref, les mouches sont chargées dans les flacons, le numéro de vol affichant LORR sédation ou reçu sont toutes les 5 minutes pendant l'exposition à la vapeur d'alcool, et le nombre total de mouches comptées à la fin de l'expérience.

  1. Avant de commencer l'expérience, exécutez l'air à travers le système (air barboter dans des bouteilles d'eau et d'alcool) pendant au moins 10 min et utiliser ce temps pour calibrer les flux d'air.
  2. Débranchez la libération rapide d'arrêter le flux d'air. Chargez les mouches dans les flacons, et rebranchez le flux d'air et commencer les minuteries. Remarque: Si les mouches qui ne répondent pas ou mouches mortes sont laissées dans les flacons de retenue, cela pourrait être une indication de conditions de stress. En général, ces conditions peuvent être soulagés en logeant moins de mouches dans les flacons de maintien ou de diminuer la viscosité des aliments en utilisant une légèrela concentration en gélose ment plus élevé pendant la préparation des aliments. Pour les analyses comportementales optimales et une variabilité minimale entre les expériences, vol doivent être en bonne santé avant les expériences.
  3. Pour la tenue de l'heure exacte, utilisez une minuterie pour garder une trace de la durée totale de l'exposition de l'alcool et d'utiliser un second minuteur-retour pour marquer les intervalles de 5 min.
  4. Placez un morceau de papier blanc sous les coupes pour augmenter le contraste et voler visibilité, en particulier dans des conditions de faible lumière rouge.
  5. Vérifiez régulièrement le flux d'air lors d'une expérience de maintenir des niveaux constants. Généralement, une fois que les flux d'air se sont stabilisés, ils restent stables pendant la durée de l'expérience.
  6. Comptez le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement, une fois toutes les 5 minutes pendant une période de 1 heure. Comme la sensibilité à l'alcool varie entre génotypes et des arrière-plans génétiques, il peut être souhaitable d'effectuer des évaluations plus fréquentes ou de procéder à l'expérience pendant une période de temps plus longue.
  7. Soulevez le slightl flacony à partir de la surface, et à diriger la lumière provenant d'une lampe-torche de lumière rouge vers le papier derrière le flacon. Gardez les lampes de poche rouges à main à une distance d'au moins 12 pouces dans le flacon expérimental pour maintenir des niveaux ne dépassant pas 1 lux de lumière pour toutes les expériences dans des conditions de faible lumière rouge.
  8. Mesurer les niveaux d'éclairage utilisant un posemètre à établir des normes pour toutes les expériences.
  9. Déterminer le nombre de mouches qui ont perdu leur réflexe de redressement en appliquant un robinet ferme le flacon et compter le nombre de mouches ne parviennent pas à se redresser dans environ 4 sec. Les mouches qui affichent Lorr peuvent encore bouger les jambes et les ailes, mais ne peuvent pas se transformer en position verticale.
  10. A la fin de la session, compter le nombre total de mouches dans chaque flacon.
    Remarque: Parfois, une seule mouche peut être pris entre le bouchon et le côté lors du chargement vole dans les flacons expérimentaux. Comme cela se fait dans l'obscurité, il ne peut pas être facilement remarqué, il est donc nécessaire de compter le engourdi totaleer de vol à la fin de l'expérience de calculer correctement les pourcentages.

En outre, ce procédé peut également être utilisé pour mesurer la sédation de vol, qui représente un critère d'évaluation du comportement différent. Alors que les mouches sédation ont perdu leur bon réflexe, la sédation nécessite une plus grande exposition à l'alcool. Comportemental, la sédation peut être caractérisé par l'absence totale de l'activité motrice apparente avec des mouches restant immobile dans le flacon après le cabinet d'aa robinet dans le flacon. Pour la sédation, compter le nombre de mouches qui restent immobiles sans jambe en agitant après la livraison d'un robinet cabinet du flacon. En outre, le flacon peut être roulé côté à l'autre afin de déterminer si les mouches individuels conservent leur réflexe saisissant.

4. Analyse des données

  1. Déterminer le pourcentage Lorr à chaque fois évaluée sur la base du nombre total de mouches dans chaque flacon.
  2. différences Estimer entre les points ou les souches de temps circadiens par calculating du LORR de 50% pour chaque échantillon qui tombe à l'intérieur de la partie linéaire de la courbe sigmoïde (voir figure 2 ci-dessous).
  3. Autres statistiques:
    1. Si la comparaison entre les génotypes sont prévues, il est souhaitable d'analyser tout le cours du temps en utilisant des mesures répétées ANOVAand pour déterminer la plage de points de temps que les différences sont significatives par tests post-hoc (Figure 3). Pour ces tests, nous préférons utiliser une valeur de 0,001. Ceci permet à des différences des temps d'exposition individuelles à évaluer ainsi que les différences entre les génotypes à la pente de la courbe.
    2. Les différences de sensibilité pour peuvent être déterminées pour des moments précis de l'exposition à l'alcool pour une réponse particulière tels que la sédation de la partie linéaire de la courbe (figure 4).
    3. Les différences entre les souches ou les points de temps circadien peuvent être estimées en utilisant F-statistiques standards et des tests post-hoc.

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Résultats

Modulation circadienne de l'alcool Sensibilité à l'aide de 50% Lorr comme un marqueur.

Un exemple représentatif montrant modulation circadienne de la sensibilité de l'alcool au cours de la journée est présenté à la figure 2. Lorr a été mesurée à six points dans le temps au cours de la 2 e journée de DD à Canton-S et les 50% Lorr a été déterminée pour chaque point de temps. L'analyse a montré un effet significatif du moment de la journée (ANOVA: F <...

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Discussion

Les coûts de l'abus d'alcool et l'alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d'un grand nombre d'individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l'alcool 5,7,32-34 circadien 35-37.

Ici, nous avons décrit un protocole simple po...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l'ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d'alcool Fabricant.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alcool 190 proofDivers
AérateurAnimalerieNous utilisons Whisper 60
Tube en silicone 1/8"VWR408060-0030
120° ; Connecteur en YVWR82017-256
Déconnexions rapidesVWR46600-048
Colliers de serrage en plastiqueProduits Bell-art132250000Soit ce dernier, soit le suivant
Régulateur d’air miniatureMcMaster-Carr8727K11Ce dernier ou le précédent
Support de montage du régulateur d’air miniatureMcMaster-Carr9891K66
Débitmètre Gilmont taille 12VWR29895-242
Pinces à outilsMcMaster-Carr1722A43Pour tenir les débitmètres
FlaconVWR89092-722
Bouchon en caoutchouc à deux trousVWR59585-186S’adapte aux flacons
Tubes en verre Pyrex de 5 mmTrikineticsPGT5x65S’adapte le mieux au bouchon précédent
Ruban téflonQuincailleriePour obtenir un ajustement parfait dans les bouchons si nécessaire
Bouchon en caoutchouc à deux trousVWR59582-122Convient à nos bouteilles
Pipettes en verre jetablesVWR53283-768Coupé à longueur et plié par chauffage
Filet en nylon très finVWRDiverses
ampoules de 15 wattsQuincaillerieFeu
rouge zénithalFiltresLumière rouge zénithière
Mini lampes de poche avec filtres rougesMag-light
locale de lumière de sécurité rouge photographique

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