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ARNi médiée double inactivation génique et de mesure de la perception gustative chez les abeilles (

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DOI :

10.3791/50446

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25 juillet 2013

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1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons deux stratégies qui suppriment simultanément deux gènes (knockdown double gène) chez les abeilles. Ensuite, nous présentons comment utiliser la réponse d'extension trompe (PER) d'analyse pour étudier l'effet de knockdown double gène sur Honey Bee perception gustative.

Résumé

Cette vidéo montre les nouvelles techniques de l'interférence ARN (ARNi), qui régulent à la baisse deux gènes simultanément dans les abeilles en utilisant l'ARN (l'ARN double brin) injections double brin. Il présente également un protocole de réponse d'extension du proboscis (PER) d'essai pour mesurer la perception gustative.

Inactivation génique médiée par ARNi est une technique efficace la régulation négative de l'expression du gène cible. Cette technique est généralement utilisée pour la manipulation d'un seul gène, mais il a ses limites pour détecter les interactions et les effets conjoints entre les gènes. Dans la première partie de cette vidéo, nous vous présentons deux stratégies pour frapper simultanément sur les deux gènes (appelées knockdown double gène). Nous montrons les deux stratégies sont en mesure de réprimer efficacement deux gènes, vitellogénine (VG) et ultraspiracle (USP), qui sont dans une boucle de rétroaction réglementaire. Cette approche knockdown double gène peut être utilisé pour disséquer les interrelations entre les gènes et peut être facilement appliqué dansdifférentes espèces d'insectes.

La deuxième partie de cette vidéo est une démonstration de l'extension réponse dosage trompe (PER) chez les abeilles après le traitement de knockdown double gène. Le test PER est un test standard pour mesurer la perception gustative chez les abeilles, qui est un indicateur clé de la rapidité de maturation sur le comportement des abeilles est. Grand perception gustative des abeilles nid indique le développement comportemental augmenté, ce qui est souvent associée à un plus jeune âge au début de la recherche de nourriture et d'alimentation spécialisation dans le pollen. En outre, par essai peut être appliqué à identifier les états métaboliques de satiété ou de faim chez les abeilles. Enfin, par dosage combiné avec appariement différents stimuli odorants pour le conditionnement des abeilles est également largement utilisé pour les études de l'apprentissage et la mémoire chez les abeilles.

Introduction

L'interférence ARN (ARNi) est gene silencing post-transcriptionnelle basée sur l'ARN, qui se produit dans une grande variété d'organismes eucaryotes. Le processus de RNAi est déclenchée par l'ARN (ARNdb) précurseurs bicaténaires endogènes ou exogènes. L'ARN double brin active la protéine Dicer de ribonucléase qui lie et clive l'ARN double brin en petits fragments (20-25 pb). Ensuite, les petits fragments d'ARN double brin le guide la reconnaissance et le clivage d'ARNm complémentaires par les protéines Argonaute, un composant catalytique de complexe RNA-induced silencing (RISC) 1. Chez les mammifères, ARNdb plus de 30 nt, activent une réponse antivirale (réponse interféron, IFN), qui conduit à une dégradation non spécifique des ARN transcrits 2. Cependant, à long ARN double brin sont avérées efficaces et spécifiques chez les insectes car il ya un manque de ce IFN 3.

Longs ARNdb ont été utilisés pour la régulation négative des gènes cibles de différentes espèces d'insectes. Les abeilles sont l'un des pionorganismes EER d'insectes dans lequel les fonctions de nombreux gènes importants dans le développement et le comportement ont été révélés en utilisant l'ARN double brin 4,5. Plusieurs méthodes de livraison ARNdb ont été réalisées chez les abeilles: ARNds alimentation régule négativement efficacement l'expression du gène cible en larves d'abeilles 6, alors que l'injection ARNdb est une approche efficace pour inactivation génique dans le miel embryons d'abeille 4 et les abeilles adultes 7,8.

effets knockdown de gènes exposées en appliquant ARN double brin pour les insectes sont transitoires et localisée. Des études ont montré que les injections d'ARN double brin abdominaux et les injections de ARNds thoraciques réprimer efficacement l'expression du gène cible dans les cellules du corps de graisse abdominale d'insectes 9,10. ARNdb est injecté dans les cavités abdominales et thoraciques et des cellules de graisse corporelle sont en mesure de prendre l'ARNdb de l'hémolymphe où les cellules sont baignées 10. Toutefois, les gènes dans d'autres organes, tels que les ovaires et le cerveau, ne peuvent pas être ciblés par l'une desinjections abdominales ou thoraciques. Afin de cibler des gènes dans le cerveau d'abeille, l'injection du cerveau de l'ARN double brin a également été réalisée, ce qui influence de manière efficace l'expression d'un gène cible dans des zones du cerveau locaux 11. Ici, nous ne documentons injection d'ARN double brin abdominale qui est plus couramment utilisé dans les abeilles adultes.

RNAi a été principalement utilisé pour cibler un gène unique et a été un outil puissant pour révéler la fonction des gènes. Cependant, n'importe quel gène n'est pas isolé des autres, c'est dans les réseaux de régulation complexes. Une clé pour comprendre un processus biologique consiste à disséquer la façon dont les gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui nécessite des manipulations simultanées de gènes multiples plutôt qu'un seul inactivation génique. Dans les lignées cellulaires de mammifères, les scientifiques ont réussi à inhiber simultanément deux ou trois gènes en utilisant des systèmes de livraison de 12 ou multi-microARN (miARN) conçoit en épingle à cheveux 13. Mais chez les insectes, plusieurs passes rabattues de gènes sont encore testés. Ici, nous présentastratégies t d'injection différents, qui peuvent atteindre un effet de choc à double gène. Nous ciblons deux gènes: vitellogénine (VG) qui code pour une protéine précurseur jaune et ultraspiracle (USP) qui code pour un récepteur putatif de l'hormone juvénile (JH) et peut servir comme un facteur de transcription médiation des réponses à JH 14 chez les abeilles. Vg et JH régulent mutuellement dans une boucle de rétroaction 15 et sont impliqués dans la régulation du comportement abeille 9. En utilisant la double inactivation génique, nous perturbent à la fois Vg et les voies JH, et découvrez comment ils affectent conjointement le comportement des abeilles et de la physiologie et comment vg, USP et JH interagissent 9.

Perception gustative est un facteur prédictif du comportement des abeilles mellifères comportement social 16. En termes de développement, de comportement des abeilles nid avec grande perception gustative comportemental rapides maturité, et généralement fourragères tôt dans la vie et préfèrent recueillir le pollen 16,17. Bien que la réglementation mECANISMES qui sous-tendent la perception gustative sont encore peu claires, des études ont montré que la perception gustative est liée à métabolismes internes d'énergie 9, la sécrétion hormonale 18,19 et biogénétique amine voies 20. Les deux Vg et JH sont des régulateurs hormonaux importants moduler la perception gustative 7,21. En laboratoire, une variation de la perception gustative chez les abeilles peut être évaluée en testant la réponse extension du proboscis (PER) de différentes solutions de saccharose. Chaque abeille est testé par toucher son deux antennes avec une goutte d'eau suivie d'une série ascendante de concentration de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% de saccharose. Une réponse positive est à noter si une abeille s'étend pleinement ses trompe quand une goutte d'eau ou saccharose est touché à chaque antenne. Basé sur le nombre de réponses positives aux solutions, le niveau de perception gustative de chaque individu peut être déterminé 16. Toutefois, l'application de la PER ne se limite pas à la mesure de gperception ustatory. Le PER est aussi une méthode efficace pour tester l'état métabolique des abeilles tels que la satiété contre la faim. Les abeilles avec des réponses plus au saccharose ont plus faim en général (Wang et Amdam, données non publiées). Par ailleurs, le paradigme PER peut également être utilisé dans l'apprentissage associatif et de la mémoire chez les abeilles. Dans ce cas, les abeilles seront formés à associer la présence d'eau de saccharose avec une odeur. Quand les abeilles apprennent l'association, seule la présence de l'odeur peut susciter une réaction de trompe positif sans les récompenser avec le saccharose 22,23. Dans cette vidéo, nous montrons comment réaliser PER d'évaluer la perception gustative qui a été connecté avec vg et usp à double effet de choc dans une étude précédente 9.

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Protocole

Partie 1: ARNi à médiation knockdown double gène

1. ARNds Synthèse

  1. amorces de conception d'ARN double brin ciblant vg, USP et un gène codant pour la protéine de fluorescence verte de contrôle (GFP) qui n'est pas à l'abeille génome: amorces ont été conçues en utilisant le logiciel gratuit en ligne Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. synthèse ARN double brin pour vg, USP et GFP: utilisation du système de production RiboMax T7 RNA de Promega pour la transcription in vitro.
  3. ARNds purification:
    1. Dénaturation et renaturation: chaleur l'ARNdb à 85 ° C pendant 5 minutes et laisser refroidir à la température ambiante pendant 1 heure.
    2. Traitement à la DNase I: ajouter 1 pl DNase I dans chaque réaction ARN double brin et mélangez-les en tapotant les tubes. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    3. Ajouter 150 ul d'eau sans nucléase et 750 ul TRIzol - LS dans chaque réaction et mélanger doucement par invErting le tube. Incuber les échantillons pendant 5 min à 30 ° C.
    4. Ajouter 200 ul de chloroforme dans chaque échantillon. Mélanger vigoureusement pendant 20 secondes. Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 12000 g à 4 ° C.
    5. Transférer le surnageant à chaque nouveau tube et ajouter 500 ul d'alcool isopropylique dans chaque tube. Mélangez-les en inversant le tube. Incuber le mélange pendant 20 min à -20 ° C. Centrifuger pendant 10 min à 12000 g à 4 ° C.
    6. Retirer le surnageant et utiliser 1,000 ul d'éthanol à 75% à laver le culot. Après centrifugation le tube pendant 5 min à 7500 g à 4 ° C, l'air sec l'ARNdb granulés, et utiliser l'eau sans nucléase de dissoudre la pastille. Afin d'assurer l'efficacité de la régulation génique, la concentration ARNds devrait être d'environ 9 -10 pg / pl.

2. ARNds injection abdominale

Pour un effet à double gène, il ya deux stratégies: 1) injection unique: mélange ARN double brin de deux gènes et Inject le mélange; 2) deux jours injection: injecter le premier ARN double brin ciblant un gène sur le premier jour, et injecter le second ARN double brin dans les mêmes abeilles sur le deuxième jour.

  1. Froid nouvellement émergé abeilles dans une ° C réfrigérateur 4 pendant 1-2 min. Quand les abeilles sont immobilisés, monter 3-4 abeilles en parallèle sur des boîtes de Pétri remplies de cire solide avec des épingles insectes croisés entre leurs abdomens et thoraces.
  2. Refroidir les abeilles à nouveau dans un réfrigérateur ° C 4. S'assurer que les abeilles sont totalement immobile. Il faut environ 1-2 min. Les abeilles doivent regarder lâche. Si les abeilles deviennent courbés ou tordus, cela signifie qu'ils sont refroidis trop longtemps qui devrait être évité. Chilling provoque trop forte mortalité, mais une immobilisation complète est important que tout mouvement augmente la taille de la blessure et de mortalité.
  3. Mettez une couche jetable aiguille 30 G (BD) sur une micro seringue Hamilton. Prenez 3 ARNds ul et s'assurer qu'il n'y a pas de bulle d'air dans la seringue. L'aiguille est insérée à un côté de l'abdomen pour éviter damaging organes internes. Appuyer lentement le piston de la seringue pour permettre à l'ARN double brin qui doit être absorbée. Etant donné que l'ARN double brin est très visqueux, il faut deux à trois secondes à être complètement expulsé de la seringue. Après avoir complètement poussant sur le piston, laisser l'aiguille dans la plaie pendant 4-5 sec. Observez les abeilles pendant 3-5 sec après les injections. Si un hémolymphe fuites de gouttelettes de la plaie, jeter l'abeille.
  4. Utilisez des couleurs différentes pour marquer leurs thoraces correspondant aux différents traitements. A ce stade, si la stratégie d'injection unique a été utilisé, les abeilles peuvent être replacés dans une colonie après 1 hr observation. Toutefois, si la stratégie d'injection de deux jours a été utilisé, après l'injection de la première ARN double brin, les abeilles doivent être placés dans une cage grillagée cylindre avec du miel fourni sur le côté et être maintenus dans un incubateur à 34 ° C et 80% d'humidité .
  5. Le deuxième jour, suivez les étapes 2.2 et 2.3 pour refroidir les abeilles dans les cages en filet et monter sur des plaques de cire. Effectuer injections avec le deuxième ARN double brin comme il est descrilit dans l'étape 2.4.
  6. Que les abeilles se remettre à la température ambiante pendant 1 heure et les introduire dans une colonie.

Remarque: Les effets sacrifiés peuvent être détectés par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) et Western blot. En général, l'efficacité du knockdown est variable et dépend de nombreux facteurs. Dans notre étude, la double inactivation génique peut être détecté 7 jours après une seule injection et les injections de deux jours.

Partie 2: Extension réponse dosage Proboscide (PER)

1. Collecte des abeilles de la ruche

Au jour 6 après les injections, collecter les abeilles traitées de la colonie sans l'aide d'un fumeur. Recueillir les abeilles dans la maille métallique cages de cylindres. Gardez 3 abeilles dans chaque cage.

2. Abeilles de montage pour PER

Refroidir les abeilles à 4 ° C jusqu'à ce qu'elles soient complètement immobilisés. Montez chaque abeille verticalement dans un tube en plastique spécialement conçu pour les PER. Gardez l'abdomen à l'intérieur du tube par using deux petits morceaux de ruban, et de garder la tête qui sort du tube. Placer les tubes sur une grille de deux rangées de petites colonnes en plastique, et attribuer à chaque tube (abeille) avec un numéro d'identification. Ensuite, mettre les abeilles traitées sur les étagères dans un incubateur (34 ° C et 80% d'humidité) et les garder dans l'incubateur pendant 2 heures.

3. Préparer une série de saccharose Water Solutions

Préparer 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% et des solutions aqueuses de saccharose de 30% et de charger les solutions dans des seringues ayant des aiguilles de G 15-20.

4. Par essai

Touchez l'antenne de l'abeille avec une gouttelette de solution de 0% (eau), suivie par des solutions aqueuses de saccharose 30% à 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% et. Testez toutes les abeilles avec de l'eau en premier et attendre au moins deux minutes que l'intervalle entre chaque solution est utilisée. Par conséquent, nous avons habituellement au moins 20 abeilles pour chaque essai. Si une abeille s'étend pleinement ses trompe, une réponse positive est compté.

5.Gestion des données

Résumer le total des réponses positives pour chaque individu pointage de réponse gustative (GRS) pour. Effectuer une analyse statistique appropriée des données.

Partie 3. validation des inactivation génique

Corps gras sont disséqués par un autre ensemble de 7 jours vieilles abeilles traitées. Une procédure Trizol standard est utilisé pour l'extraction de l'ARN, qui est suivie par la DNase traitement I 24. Vg et l'expression du gène USP est analysé par un à deux étapes qRT-PCR. Actine est utilisé en tant que gène de référence, car il a des expressions stables dans différents tissus des abeilles mellifères. Amorces de PCR en temps réel publiés pour VG et le gène USP sont utilisés dans cette expérience 24. Les données sont analysées à l'aide de Delta-Delta méthode CT 25.

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Résultats

Tant les deux jours de l'injection stratégies mono-injection et réduit de façon significative vg (One-way ANOVA, p <0,001) (figure 2A) et l'USP (One-way ANOVA, p <0,001) (figure 2B) les niveaux de transcription chez les abeilles six jours après l'ARNdb a été injecté. La suppression de l'USP transcription en utilisant l'injection unique avec un mélange ARN double brin et l'injection de deux jours avec vg premier et second ...

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Discussion

Notre étude est la première tentative de frapper simultanément sur les deux gènes chez les insectes adultes. Nos résultats montrent que les deux stratégies d'ARN double brin injections (une seule injection et l'injection de deux jours) sont efficaces pour la répression du gène double, et gene silencing simultanée de VG et USP peuvent être testés 6 jours après les injections ARN double brin dans les abeilles 8,9. Cependant, le gène knockdown efficacité varie selon les espèces d'in...

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Déclarations de divulgation

Nous n’avons rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Erin Fennern pour aider expérience. Ce travail a été financé par le Conseil norvégien de la recherche (180504, 185306 et 191699), Pew Charitable Trust, et le National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GE Healthcare Billes PCR en plaque à 96 puitsGE Healthcare27-9557-01
QIAquick PCRkit de purification Qiagen28104
RiboMax T7 Système de production d’ARNPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Chloroforme :Alcool isoamylique 24:1Sigma-AldrichC0549
isopropyliqueSigma-AldrichI9516
Hamilton micro seringueHamilton80301
30G BD aiguilles jetablesBD Biosciences305106
SaccharoseSigma-Aldrich84097
1 ml SeringueBD Biosciences30960
Microscope à stéréodissectionLeica MicrosystemsS6D
Épingles à insectesOutils scientifiques fins26000-25
Plaque
alcool de cire

Références

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Mots-clés

Injection d ARN double brinEssai de r ponse d extension du proboscisInhibition du g ne de la vitellog nineInhibition du g ne UltraspiracleR gulation g nique chez l abeille domestiqueAnalyse par PCR en temps r elTest la solution de saccharoseR gulation de l hormone juv nile

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