L'acquisition de fluorescence Time-lapse films de levure bourgeonnante et analyse de la dynamique de cellules uniques en utilisant des greffes

Résumé

Nous présentons un protocole simple d'obtenir des films de microscopie par fluorescence de cellules de levure en croissance, et un logiciel GUI basée à extraire des données de séries chronologiques unicellulaires. L'analyse comprend lignée automatisé et l'affectation du temps de division intégrée à l'inspection visuelle et la conservation manuelle de données à chenilles.

Résumé

Microscopie time-lapse fluorescence est devenu un outil puissant dans l'étude de nombreux processus biologiques au niveau d'une seule cellule. En particulier, les films dépeignant la dépendance temporelle de l'expression des gènes permettent de mieux comprendre la dynamique de sa réglementation, mais il ya beaucoup de défis techniques à obtenir et à analyser les films de fluorescence des cellules individuelles. Nous décrivons ici un protocole simple en utilisant un dispositif de culture microfluidique disponible dans le commerce pour produire ces données, et une interface graphique basée sur MATLAB utilisateur (GUI) basée sur logiciel pour quantifier les images de fluorescence. Les segments des logiciels et des cellules de pistes, permet à l'utilisateur de vicaire visuellement erreurs dans les données, et attribue automatiquement lignage et des temps de division. L'interface graphique analyse en outre la série temporelle afin de produire des traces de cellules entières, ainsi que leurs dérivées première et seconde de temps. Bien que le logiciel a été conçu pour S. cerevisiae, sa modularité et sa polyvalence devrait lui permettre de to servir de plate-forme pour l'étude d'autres types cellulaires avec quelques modifications.

Introduction

Analyse unicellulaire de l'expression génique a permis de mieux comprendre de nombreux aspects de la régulation des gènes. Instantanés statiques d'expression rapporteur fluorescent par cytométrie en flux ou microscopie fournissent des informations utiles sur la distribution de l'expression seule cellule, mais n'ont pas l'histoire et l'évolution des données de séries chronologiques nécessaires pour informer directement la dynamique de l'expression des gènes. Microscopie time-lapse fluorescence présente un moyen d'obtenir deux mesures unicellulaires et leur histoire. Diverses techniques expérimentales et analytiques ont été développées afin d'obtenir et de quantifier les films d'expression rapporteur fluorescent, conférant ainsi un aperçu des caractéristiques de régulation des gènes (cf. ¹ pour une revue) tels que la variation de cellule de la cellule ^2,3, la formation de persister bactérienne ^4, transcription initiation et d'élongation ^5, transcription éclatement ^6,7, la dépendance du cycle cellulaire ^8,9 et héritabilité ^10. Cependant, obtaining série temporelle de fluorescence unicellulaire qualité implique des difficultés techniques importantes dans la culture d'une monocouche de cellules dans un environnement contrôlable dans la quantification et à haut débit des films de fluorescence acquises. Ici, nous décrivons une procédure pour obtenir et analyser des films de fluorescence de S. cerevisiae avec aucune expérience requise dans la fabrication du dispositif de culture cellulaire ou dans le développement de logiciels (Figure 1).

Tout d'abord, nous détaillons un protocole d'exemple pour produire des films de séries chronologiques de fluorescence pour levure bourgeonnante exprimant un ou plusieurs rapporteurs fluorescents. Bien que des chambres de culture microfluidiques personnalisés ont été construits et utilisés avec succès précédemment ^11-13, nous utilisons un dispositif microfluidique disponible dans le commerce à partir de CellAsic (Hayward, CA). Le système confine à la croissance des cellules de la monocouche et permet un contrôle continu du milieu de perfusion. Le protocole de microscopie que nous présentons est un moyen simple d'obtenir Déessfilms rence de levure bourgeonnante, mais tout protocole modifié expérimental (un dispositif de culture personnalisée, les conditions de médias alternatifs, etc.) fournissant des données de films similaires fluorescence de cellules de levure simples peuvent être substitués.

Ensuite, nous présentons l'analyse des films en utilisant une interface utilisateur graphique (GUI) basée sur logiciel dans MATLAB (The MathWorks, Natick, MA), surnommé le GUI pour l'analyse rapide des séries chronologiques Fluorescence (greffes), pour extraire des données de séries chronologiques pour des cellules individuelles. GREFFES a des caractéristiques similaires à la polyvalente, logiciel open-source paquet Cell-ID ¹⁴ dans la segmentation et le suivi des cellules et dans l'extraction de l'intensité de fluorescence et de l'information géométrique. Toutefois, les greffes fournit d'importantes fonctionnalités supplémentaires. Tout d'abord, il offre une édition interactive facile de segmentation et le suivi des résultats afin de vérifier l'exactitude des données, plutôt que de simplement gating statistique des traces de la région aberrantes après analyse. En outre, elle étend l'analyse aux automatically désigné lignée et les points du cycle cellulaire d'intérêt de la levure bourgeonnante. Déterminer le moment où mère et fille se divisent pour former deux régions de cellules indépendantes est cruciale pour déterminer les mesures à travers le cycle cellulaire ⁸ cellules entières (y compris toute mère bourgeon connecté). La suite se compose de trois modules pour accomplir ces tâches. Les premières régions cellulaires segments basé sur le contraste entre les images de champ lumineux ciblés et non ciblés, et permet à l'utilisateur de définir et de tester visuellement les paramètres de segmentation. La seconde pistes (. Utilisant Blair et la mise en œuvre de la MATLAB Crocker et al IDL routine de Dufresne, disponible sur: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) et les mesures régions cellulaires à travers le temps; attribue automatiquement lignées et permet une inspection visuelle et la correction d'erreur. Une interface graphique tracé simple est inclus aux propriétés unicellulaires requête. Le troisième module attribue bourgeon émergence et la division times, et délivre des données de séries chronologiques de cellules entières ainsi que leurs dérivées premières et secondes de temps (tel que discuté dans ^9). Le module d'analyse fournit en sortie les données dans un fichier de texte délimité par des espaces pour l'étude ultérieure dans le logiciel de statistique de choix. Ainsi, le forfait permet à l'utilisateur d'extraire des données de séries chronologiques de haute qualité par le biais d'une interface graphique. Nous avons utilisé cette méthode pour estimer les taux de transcription en temps réel dans des cellules de levure bourgeonnante simples en fonction du cycle cellulaire ^9. Alors que les modules ont été optimisés pour levure bourgeonnante, les paramètres ou, le cas échéant, le code librement disponible peut être adapté à d'autres organismes et les types d'images. Segmentation, le suivi, et la lignée des algorithmes d'affectation peuvent être spécifiques à types d'imagerie affecté et l'organisme en question. Les algorithmes existants pourraient être remplacés, mais conservent l'interface graphique qui permet une inspection visuelle conviviale et la correction des erreurs de segmentation et de suivi qui invariablement occupantsr avec n'importe quel algorithme.

Protocole

1. Obtenir fluorescentes microscopie Films de cellules de levure unique qui poussent dans une chambre microfluidique

1. Inoculer 1 ml médias SC (médias définis synthétiques avec 2% de glucose et le complément complet d'acides aminés) avec des cellules d'une plaque fraîchement croissante, et incuber la culture de la nuit environ 16 heures sur un tambour à rouleaux à 30 ° C. Préparer la culture tels que le DO finale _600nm est d'environ 0,1 pour une croissance en phase logarithmique précoce.
2. Diluer la culture de départ en fonction des besoins et repousse 1 ml dans un tube à essai frais supplémentaires 6-8 heures à OD _{600 nm} = 0,1. Ceci permet d'obtenir des cellules en croissance à un état stable riche en éléments nutritifs à une densité approprié pour le chargement dans le dispositif microfluidique. (Vous pouvez remplacer les étapes 1.1-1.2 avec la procédure nécessaires pour préparer des cellules que nécessaire pour l'expérience.)
3. Préparer une plaque de culture microfluidique Y04C de CellAsic: retirer la solution d'expédition; rincer les puits avec de l'eau stérile, et en utilisant le débit du système de perfusion ONIXl'eau par des puits 1-6 à 6 psi pendant 5 minutes pour rincer les canaux. Ensuite, le débit du puits de chargement 8 à 6 psi pendant 10 secondes (le canal de chargement comporte des débits beaucoup plus élevés et doit être rincé séparément).
4. Enlevez l'eau de tous les puits et les remplacer par 250 SC ul dans l'entrée des puits 1-6 et 50 pi de la culture de l'étape 1.2 dans la cellule de chargement et 8. (Sinon, placez le support souhaité dans le puits d'entrée 1-6 pour des expériences nécessitant une commutation entre les différentes conditions.)
5. Sceller le collecteur ONIX à la plaque, et pour commencer à amorçage des canaux et de la chambre de culture par l'écoulement à partir des puits d'entrée 6.1 à 6 psi pendant 2 min suivie d'au moins 5 min à 6 livres par pouce carré de l'orifice d'entrée ainsi que le support de maintien de départ pour l' expérience. Circuler cette continuellement jusqu'à l'étape 1.7.
6. Préparer le microscope pour l'expérience. Nous utilisons un Zeiss Axio Observer.Z1 widefield microscope avec une caméra EMCCD II rétro-éclairé Cascade (Photometrics, Tuscon, AZ) et un arc Lumen 200 à halogénures métalliquesLampe (scientifique préalable, Rockland, MA) pour l'excitation de fluorescence atténué à 10% pour éviter photoblanchiment. Pour minimiser le temps de commutation nécessaire d'acquérir de multiples canaux fluorescents, nous associons un seul cube filtre triple bande passante dichroïque à l'excitation / émission des filtres appropriés pour CFP, YFP, et RFP (Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT; série 89006) Située dans commutation rapide roues à filtres externes (produits électroniques Ludl, Novato, CA).
7. Placez quelques gouttes de liquide d'immersion sur l'objectif (si nécessaire, nous utilisons un Plan-Apochromat Zeiss 63X/1.40 Oil DIC), et monter le dispositif microfluidique en toute sécurité dans le stade du microscope inversé. Assurer la plaque ne se déplace pas du tout dans la scène tout au long de l'expérience améliore le suivi de la cellule lors de l'analyse des données. Nous enregistrons simplement la plaque sur le support de la scène pour empêcher son déplacement.
8. Focus sur le troisième à gauche de la première chambre de culture (où la hauteur de la chambre est le plus petit) en utilisant l'un des intégré positiontion marqueurs. Éteignez écoulement de l'entrée des médias bien, et le débit de la cellule de chargement et 8 à 6 psi à 5 sec rafales. Déplacez le stade de regarder autour de la chambre de culture de cellules. Augmenter le temps de chargement de débit et de pression jusqu'à ce que la densité cellulaire désirée est atteinte, mais éviter de surcharger et de colmatage de la barrière à gauche où les médias frais pénètre dans la chambre.
9. Commencer s'écoulant de l'entrée de milieu et contenant le support à partir de 6 psi.
10. En MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ou d'autres automatisation de la microscopie et des logiciels de commande, installer une acquisition multi-dimensionnelle de prendre plusieurs images à multiples positions de scène au fil du temps. Définissez le nombre et l'intervalle entre des points dans le temps. Sélectionner plusieurs positions sur scène avec ~ 10 cellules chacune (plus se surcharger rapidement). Nous utilisons généralement des intervalles de 5 min et l'image jusqu'à 16 postes, qui nécessitent chacun environ 11 secondes pour que l'acquisition à chaque point de temps.
11. Configuration de l'acquisition de telle sorte que dans chaque position de phase à chaque point du temps THprogramme de e va: se concentrer sur le fond clair de lumière transmise (BF) de l'image à l'aide de méthode intégrée autofocus (mise en œuvre de l'autofocus comme un journal personnalisé écrite au début de chaque poste de scène offre un plus grand contrôle sur la précision de mise au point) de MetaMorph; acquérir le BF image au +1 um au plan focal (fp); acquérir une image BF hors foyer (BFOOF) à um -4 à la fp (utiliser revues coutume écrits de changer l'orientation selon les besoins entre les images), ou d'acquérir un niveau de gris image pour chaque rapporteur fluorescent à la fp utilisant des réglages optimisés pour l'acquisition rapide avec photobleaching minime.
12. Si nécessaire, obtenir le fond et l'ombrage des images de correction pour chaque rapporteur fluorescent dans une zone de la chambre de culture sans cellules.
13. Préparer le programme de flux pour l'expérience dans le logiciel de contrôle ONIX. Simultanément commencer le programme d'acquisition de MetaMorph et le programme d'écoulement dans le logiciel de commande ONIX.
14. A la fin de l'expérience, de rectification ONUmême arrière-plan et l'ombrage dans les images fluorescentes (si nécessaire), et éventuellement combiner les. tif pour chaque canal de l'image à chaque position de scène dans un fichier vidéo. STK (par exemple, créer BF, BFOOF, CFP, YFP et des films RFP pour la position 1 ).

2. Format et segment de données pour le suivi de l'aide du FormatData GUI dans MATLAB (Figure 2)

1. Exécutez le fichier FormatData.m dans MATLAB pour ouvrir l'interface graphique d'entrée de données. Au sommet, préciser ou accédez au dossier contenant les fichiers d'image pour définir le répertoire de données, puis utiliser l'interface graphique pour spécifier les types de données et les fichiers d'image enregistrés dans l'expérience.
2. À droite, sélectionnez le bouton radio à côté de "Time-lapse" pour indiquer le type d'analyse à effectuer. "Time-lapse" va traiter la série d'images comme une série de temps (par exemple un film de cellules en croissance dans une chambre microfluidique). "Statique" va traiter chaque série d'image comme un ensemble de photos prises à partir d'une population (par exemple des images multiples prises au DIFférentes positions sur un échantillon de diapositive). Dans cette version de greffons données time-lapse pour de multiples positions peuvent être traités mais dans un fichier distinct pour chaque poste (voir l'étape 2.14).
3. Cochez la case pour l'enregistrement d'image pour corriger les mouvements de scène imprécises en décalant chaque image dans les films de minimiser le mouvement des cellules apparent dans le cadre. Nous recommandons fortement ce que cela améliore grandement suivi (réduction de curation manuelle de piste plus tard), mais nous allons ajouter, «bruit blanc» des valeurs de pixels aléatoires à remplir où les images ont été transférés à la frontière. Il pourrait également être sélectionné après avoir visionné des images BF segmentées à l'étape 2.7 ou à tout moment avant l'étape 2.13.
4. Cochez la case "Champ Bright" dans le panneau "Data Channels". Cliquez sur «Select» pour le droit de charger les images BF. Pour *. TIF, sélectionnez toutes les images BF correspondant à un seul film en maintenant la touche Maj enfoncée tout en sélectionnant, puis cliquez sur «Ouvrir». Pour les fichiers Stk *., Il suffit de sélectionner la pile BF d'intérêt. Si les images sont réussitepleinement reconnue, les noms de fichiers sont répertoriés dans le menu déroulant à droite dans la "données reconnues" panneau. . Pour * TIF, être sûr que les noms de fichiers apparaissent dans l'ordre correct (enregistrer des fichiers avec des noms séquentiels lors de l'acquisition - BF_t001, etc.)
5. Cochez la case "Bright Field (hors-sujet)" de la boîte et utilisez la touche "Select" comme dans l'étape 2.4 pour charger les fichiers BFOOF, qui seront répertoriés dans le menu contextuel à droite. (BFOOF obtenu comme BF um -4 par rapport à la fp à 63X segments ainsi.)
6. Cochez la case "Mask Cell". Dans le panneau "Source de masque", sélectionnez le bouton radio à côté de "Segment BF". Appuyez sur le bouton "Paramètres" pour ouvrir l'interface de segmentation. (Vous pouvez également sélectionner un film de masque pré-segmentée en sélectionnant le bouton radio à côté du bouton "Sélectionner un fichier de masque", en appuyant sur celle-ci, et en sélectionnant le film comme dans l'étape 2.4. Dans ce cas, un film BFOOF n'est pas nécessaire, et peut passer à l'étape 2.8.)
7. Définissez les différents paramètres de segmentation (descriptions de chacun peuvent être visualisered en appuyant sur ​​"Description des paramètres"), et de tester la qualité de la segmentation en cliquant sur ​​"Test" (Figure 3). Réussir régions segmentées seront verts avec des frontières magenta. Assurez-vous d'utiliser le curseur de vérifier plusieurs points dans le temps dans le film. Lorsque la segmentation est satisfaisante, sélectionnez «Terminé» pour revenir aux paramètres de segmentation de l'interface graphique FormatData.
8. Cochez la case "Images de la couleur». Entrez le nom de la couleur pour le premier canal d'image fluorescente dans la zone de saisie de texte, puis appuyez sur «Ajouter et sélectionnez" pour charger les fichiers de couleur comme dans l'étape 2.4. Le nom de la couleur sera ajouté à la liste déroulante sur la gauche, et les noms de fichier sera ajouté à la table à droite. Si une erreur est commise dans le chargement des fichiers de couleurs, sélectionnez le nom de la couleur dans la zone de liste de gauche et cliquez sur "Supprimer la couleur" pour supprimer les fichiers. Répétez l'opération pour chaque canal de couleur.
9. Si masques sous-région supplémentaires basées sur l'une des couleurs fluorescentes (par exemple marqué par fluorescence noyau → nucloreille de masque de la région) sont souhaitées, cochez la case "Masque de couleur". Si non, passez à l'étape 2.12. Dans le panneau "Color Mask Source", entrez le nom du masque de sous-région dans la zone de saisie de texte. Choisissez une couleur dans le menu contextuel dans le panneau "Color Mask Source" (nécessite la couleur ont été ajoutés à l'étape 6) et pousser "Paramètres" pour ouvrir un seuil de tester l'interface graphique.
10. Appuyez sur le bouton «Auto-seuil» pour déterminer automatiquement le seuil en utilisant la méthode d'Otsu ^15, et l'image mettra en évidence les zones préservées au-dessus du seuil (Figure 4). Le seuil peut être réglé manuellement à l'aide de la boîte d'édition. Utilisez la barre de défilement pour confirmer le seuil est approprié pour tous les temps. Lorsque vous êtes satisfait, appuyez sur «Terminé» pour revenir au seuil de l'interface graphique FormatData.
11. Push "Ajouter et Segment" pour générer le masque de sous-région à l'aide du module de seuil appliquée aux images de couleurs sélectionnées. Le nom du masque de couleur et la source seront affichés dans le tableau à gauche, avec le r pertinenteles noms de fichiers ecognized figurant dans le tableau à droite. (Vous pouvez pousser "Ajouter et sélectionnez" pour charger les fichiers pré-faites de masque sous-région.)
12. Au fond, spécifiez ou recherchez le dossier souhaité pour être utilisé comme répertoire de sauvegarde.
13. Appuyez sur "Data Format" pour lire les fichiers image (en utilisant le code tiffread2.m développé par François Nedelec, disponible sur: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), le traitement des données, et de créer une * fichier. tapis dans le dossier spécifié. Ce fichier servira d'entrée à l'interface graphique ProcessTimeSeries.
14. Répétez l'étape 2.4 à 2.13 pour l'ensemble des films pour chaque position de la scène.

3. Les cellules de la voie et des lignages dans le temps avec ProcessTimeSeries GUI, et curé ID et affectations de Lineage (figure 5)

1. Exécutez le fichier ProcessTimeSeries.m dans MATLAB pour ouvrir l'interface de suivi. Définissez les paramètres suivants après l'ouverture duGUI:
   • «Hauteur Chambre" ("File I / O" panneau en haut à gauche) - ce qui indique la hauteur de la chambre dans laquelle les cellules sont piégées. Il est utilisé en tant que contrainte en rapprochant volume de la cellule comme une ellipsoïde 3D ​​sur la base de l'axe majeur et mineur de la région de la cellule comme dans ^8.
   • "Um / pixel" (panneau "I / O file") - le facteur de conversion pour calibrer pixel de la distance um dans les images afin section transversale et le volume peuvent être calculées en um um ² et ^3, respectivement.
   • "Panneau Filtres" (ci-dessous "Fichier I / O" panneau) - ensemble minimal et paramètres maximum pour filtrer les régions à haut risque dans le masque: "Zone" - zone de la région en pixels "Ecc" - facteur d'excentricité, plus circulaire que → 0 , "SF" - facteur de forme plus circulaire que → 1.
2. Cliquez sur "Charger les images" dans le panneau "I / O Fichier" et sélectionner le fichier de données *. Mat de sortie d'intérêt par la GUI FormatData. Le masque de la région (et tous les masques de sous-zone) est appliqué à chaque canal de couleurEt un certain nombre de mesures sont effectuées (tableau 1). Le fichier de données est alors enregistrée. (Si vous chargez un fichier dans ProcessTimeSeries d'une session précédente, il vous demandera si l'analyse doit être recommencé depuis le début. ATTENTION:. Ceci effacera tout curation de piste déjà terminé et traiter les données comme si elles étaient fraîches en provenance de l'interface graphique FormatData Si accidentellement redémarré, rapidement appuyez sur Ctrl + C dans la fenêtre de commande MATLAB pour empêcher le fichier. mat * précédemment organisée d'être remplacée.)
3. Ensuite, suivre les cellules. Dans le panneau "Cellules Track" (à côté du panneau «Filtres»), définissez les paramètres suivants:
   • "Déplacement Max" - la distance maximale en pixels d'une cellule peut voyager entre des images adjacentes, avant d'être étiqueté comme une cellule différente. Déplacement plus élevé signifie l'algorithme peut expliquer les cellules mobiles plus, mais elle augmente également la complexité de mise en correspondance des régions cellulaires dans la foule. Nous commençons à 12 ans et diminue si une erreur se produit dans le suivi (voir l'étape 30,4).
   • "Longueur minimum" - un nombre minimal d'occurrences pour une trace de cellules à prendre en considération une série de données valides. Nous utilisons 1 pour empêcher le retrait de toutes les traces réelles, mais ce peut être augmenté si les résultats de segmentation dans les traces de la région à court terme, de parasites.
   • "Mémoire du cadre" - nombre maximum de trames consécutives une région de cellule peut disparaître et être donné le même ID quand il retourne. Si elle disparaît pendant plus de "Mémoire du cadre", il sera donné une nouvelle identité à son retour. Nous utilisons 2 à permettre aux régions d'être manquées par segmentation pour 2 cadres avant de revenir.
4. Cliquez sur "Cellules de route» pour suivre les régions d'une image à l'autre en utilisant les centres de gravité de la région (Blair et Dufresne mise en œuvre de MATLAB Crocker, Grier, et Weeks IDL routine, disponible à l'adresse: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , pour attribuer lignées de bourgeons nouvellement comparants, et pour sauvegarder les données. Lignées sont automatiquement assignés par minimizing distances entre les bourgeons putatifs et les mères potentielles dans chaque trame. (Si une erreur s'affiche dans la fenêtre de commande MATLAB en raison de «combinatoire difficiles», diminuent "Déplacement Max" et répètent suivi.) Modifier les paramètres dans les fenêtres popup que nécessaire pour vos données.
5. Curé régions et les erreurs dans ID ou missions de la lignée mal segmentées en utilisant les différents outils graphiques ou des touches de raccourci (montré dans une fenêtre contextuelle en appuyant sur le bouton ci-dessus panneau "Informations de cellules sélectionnée").
   • Curseur, "image Image précédente", "image suivante" (Ctrl + gauche / droite) - utiliser pour afficher et déplacer entre les images de la série d'images.
   • "N ° de l'image" - affiche le numéro de trame de l'image courante dans les axes gauche et droit. Déplacer vers un cadre spécifié en tapant son numéro dans le droit "image #" zone d'édition.
   • "Frame Delta" - montre la différence dans le nombre de trames entre les axes gauche et droite (Δ = droite - gauche).
   • "Hide Text" (Ctrl + T) - permet de basculer entre l'affichage des ID de cellules dansles bons axes ou non.
   • "Masquer les étiquettes" (Ctrl + L) - bascule entre l'affichage des ID de cellules dans les axes de gauche ou non.
   • "Mask" menu contextuel - choisir entre l'affichage sans masque, le masque cellulaire, ou tout sous-masques définis par l'utilisateur pour l'affichage dans le panneau de gauche.
   • Menu contextuel "Overlay" (Ctrl 1-9) - choisir d'afficher BF et des couches de couleur dans le cadre de gauche. Voir BF est le seul qui permet de basculer la couche BF ou désactiver dans les deux axes. Basculer entre l'affichage ou non en sélectionnant le nom de la superposition dans le menu à nouveau ("*" désigne overlay est affiché). Ctrl +1 bascule BF superposition, avec 2-9 basculer les superpositions de couleurs dans l'ordre.
   • "Définir les couleurs» - Utilisez pour déterminer la couleur pour l'affichage de superposition. Une fenêtre va interroger le canal de fluorescence à régler, puis la palette de couleurs apparaîtra pour la définition de l'utilisateur.
   • "Modifier Régions et Tracks" panneau - ces contrôles apporter des changements sur le masque de zone de cellule et les informations de trace:
     • "Mettre à jour les pistes" (Ctrl + U) - utilisent à nouveauaffecter des ID de cellules. Si aucun cellules sont sélectionnées dans les axes droite, l'interface graphique demandera un identifiant de cellule à changer. Lorsque ID X est remplacé par Y, toutes les futures instances de X seront modifiées afin de Y, et toutes les instances futures du Y actuel, seront passés à X. (Parfois une cellule basculer entre 2 cartes d'identité, à plusieurs reprises. Ce est due à la poursuite essayant d'accommoder plusieurs ID dans une région oversegmented plutôt que d'une erreur dans la fonction d'identification de mise à jour.) Plusieurs cellules peuvent être sélectionnées et leurs identifiants modifiés simultanément, mais assurez-vous de donner à chacun un numéro d'identification unique. Pour affecter une région à une identification qui n'existe pas dans le fichier actuel, inscrivez «0» et vous sera généré. Utilisez Ctrl + W pour échanger les identifiants des deux cellules sélectionnées.
     • "Supprimer des pistes sélectionnées" (Ctrl + D) - utiliser pour supprimer la cellule sélectionnée ou plusieurs régions de cellules dans le cadre actuel des axes droite. (Si aucun cellules sont sélectionnées, vous invite à ID.) Pour supprimer définitivement toutes les instances d'une trace d'identité, cochez la case à côté du DeLete bouton Selected Tracks (texte passera à "éliminer tout"). Ceci est utile pour se débarrasser des régions à haut risque persistants, mais vérifiez d'abord futures trames pour s'assurer que le ID ne passe pas à une cellule valide ou région d'œuf.
     • "Fusionner les régions" (Ctrl + A ou M) - adoucit et combine régions cellulaires. Cliquez sur une ou plusieurs cellules dans les bons axes pour sélectionner (région devient rouge si elle est sélectionnée). Fusion sur une région sera morphologiquement proche pour remplir des fissures ou des petits morceaux manquants à l'aide d'un élément en forme de disque. La fusion de deux ou plusieurs régions voisines se combiner en une seule région et de donner le plus petit ID de la nouvelle région. Ceci est utile pour les régions sur-segmentées (souvent lorsque les cellules ont de grandes vacuoles).
     • «Dessine-région» - Utilisez la souris pour dessiner une région dans les bons axes endroit désiré et double-cliquez pour terminer. Fournir un identifiant unique pas présent dans l'ensemble de données (entre 1 et 65535). Annuler en appuyant sur Suppr du clavier.
   • "Lineage Tracking" panneau - après le suivi,travaux de lignage sont générés automatiquement. Lorsque de nouvelles régions d'identité apparaissent, le nouvel identifiant de cellule apparaît en rose et une ligne rouge est attirée sur la région de la mère. De nouvelles régions trop grandes pour être bourgeons ou trop loin de mères potentielles apparaissent en vert et se voient attribuer un ID de la mère de «Nan» («pas un nombre», voir tableau 2). Régions existant au premier point dans le temps ont une identification de la mère de "0". Pour fixer les affectations individuelles, entrez la mère et les ID des bourgeons dans les domaines de l'édition de texte et cliquez sur "Fix". Pour effacer la mère d'une cellule, inscrivez «0» comme sa mère. Une méthode plus rapide consiste à sélectionner deux régions dans l'image de droite et appuyez sur Ctrl + F. Cela assignera automatiquement la région plus que la mère et la région récente comme la fille, tout en effaçant toutes les affectations de mère déjà existantes pour la cellule fille. ATTENTION: en cliquant sur «Calculer lignées" à tout moment recalculera toutes les missions de la lignée, y compris celles que l'utilisateur a préalablement organisée.
   • Panneau "Selected d'infos cellule» - «Je Obteneznfo "affichera des mesures des régions sélectionnées dans les bons axes." mesures ... "permet à l'utilisateur de déterminer quelles mesures sont affichées (ainsi que définir la liste par défaut pour d'autres opérations telles que" Exporter des données "). Peut être utilisé pour déterminer les ID et les lignées (par exemple, si la cellule X est un bourgeon à l'instant t, il est fort probable ne pas avoir un autre bouton à l'instant t + 5 min) correctes.
   • "Enregistrer les modifications" (Ctrl + S) - mises à jour le fichier * mat pour refléter les changements de l'utilisateur.. Utilisez fréquemment (il n'ya pas de fonction d'annulation)!
   • "Générer Parcelles" - ouvre l'interface graphique GeneratePlots. Utilisé pour tracer rapidement sélectionné des informations variables et des calculs simples pour les régions mono-cellulaires mis en évidence dans les bons axes de la GUI ProcessTimeSeries, leur moyenne, ou la moyenne de toutes les régions dans chaque trame. Cette interface graphique peut calculer les dérivées premières brutes, mais n'oubliez pas de préciser l'intervalle de temps correct en haut à gauche. Parcelles peuvent être restitués à un chiffre pour l'enregistrement en appuyant sur "Générer la figure".
6. Pour curé correctement les données: fusionner les régions oversegmented, supprimez les régions non capturant l'ensemble de la cellule; n'oubliez relations mère-bud sont correctement assignés (une ligne rouge apparaît entre eux au moment de l'émergence bourgeon, lorsque l'ID bourgeon est rose, voir Tableau 2), et éliminer tout ID vertes par la fixation de l'ID, l'attribution de la région d'une mère, sans affecter mère ("0"), ou la suppression de la région. Bud données seront ajoutées à celle de la mère lors de l'analyse finale afin de ne pas fusionner une région de bourgeon de sa mère (elle conduira à l'estimation du volume inexacte).
7. Inspecter visuellement les données pour chaque trame jusqu'à la dernière heure d'intérêt, mais il n'est pas nécessaire de l'ensemble de la période, si vous n'utilisez pas les cadres ultérieure.
8. Assurez-vous d'enregistrer les changements.
9. Répétez les étapes 3.1-3.7 pour le fichier *. Mat pour chaque position de la scène.

4. Exportation de données pour l'analyse

1. Pour simplement exporter mesures région brutes pour chaque cellule par time, appuyez sur "Exporter des données". Les mesures d'intérêt peuvent être sélectionnés dans l'interface graphique qui s'ouvre, et ils le seront dans un espace délimité *. Txt avec des noms de variables que les en-têtes de colonnes.
2. Pour analyser les séries chronologiques pour les cellules entières dans le temps, de calculer les informations du cycle cellulaire, et de prendre des produits dérivés, pousser "Analyse des séries chronologiques". Une fenêtre s'ouvre permettant de sélectionner les mesures d'intérêt et l'entrée des paramètres d'analyse (Figure 6).
3. Entrez le dernier point de temps organisée dans l'interface graphique (toutes les images suivantes seront ignorés). Les paramètres d'affectation par défaut lissage et cycle cellulaire fonctionnent bien pour notre haploïde et souches diploïdes imagées à intervalles de 5 minutes, mais il faudrait peut-être modifié pour de meilleurs résultats. (Vérifiez que les valeurs des paramètres sont appropriés en déterminant manuellement temps en herbe et la division d'un ensemble de données de test et de comparaison de la performance de l'algorithme automatisé.)
4. Lorsque tous les paramètres sont réglés, appuyez sur "Analyser" pour:
   1. Moinstruct tableaux pour chaque mesure brute et soustraire le fond (mesuré comme l'intensité moyenne de la zone de non-cellule de la première trame dans chaque film fluorescent, ou qui peut être complétée pour tenir compte de l'autofluorescence moyenne par pixel de la cellule).
   2. Monter une spline de lissage pour les mesures sélectionnées pour éliminer le bruit de mesure haute fréquence (tel que discuté dans ^9).
   3. Déterminer automatiquement apparition des bourgeons et des temps de division cellulaire pour chaque cellule en fonction des changements dans la pente de la série chronologique du volume abordés à ^9. Les mesures de bourgeon seront alors ajoutés aux mesures de la mère entre émergence et la division de chaque cycle pour toute une série de temps de la cellule contiguë. Une progression du cycle cellulaire normalisé sera également calculée allant de 0 à 2 de division en division.
   4. Monter un lissage spline de prendre stables 1 ^er et 2 ^nd dérivés des mesures sélectionnées. (Aux fins de dérivés bien définis, des séries chronologiquessont fabriqués en continu à travers la division en décalant les données pour le cycle cellulaire suivant pour satisfaire le critère pour le cycle précédent.)
   5. Sortie brut et des séries chronologiques lissée pour toutes les régions, et tout lissée de la cellule, continue et séries chronologiques différencié comme un tableau pour chaque mesure. Le premier élément est un indice de couleur de fond de la soustraction, le reste de la première rangée occupe ID de cellules, le reste de la première colonne indique le numéro de trame, et les éléments restants maintenir la série chronologique pour chaque cellule dans une colonne, chaque rangée correspondant à la trame de la première colonne. Un tableau similaire du cycle cellulaire des séries chronologiques de la progression et de l'information de lignage sera également sortie. Le tableau "LineageArray" contient une table avec chaque ligne représentant une relation mère-bourgeon et la première à la cinquième colonnes sont ID de mère, bourgeon ID, cadre de la première région de bourgeon, cadre en herbe estimée, et le cadre de la division estimé. Les données sont exportées dans un fichier *. Mat (fichier de données MATLAB).

Résultats

Une expérience réalisée et analysée avec succès donnera série surtout à temps continu pour les cellules entières simples avec réalisme attribué apparition des bourgeons et des temps de division. À titre d'exemple, nous avons réalisé le protocole ci-dessus avec une souche de levure haploïde exprimant une copie intégrée de la protéine fluorescente Cerulean (CFP) entraînée par le promoteur constitutif ADH1 d'observer comment la croissance et l'expression globale peuvent varier au fil du temps ...

Discussion

Le protocole ci-dessus décrit une méthode simple pour obtenir et analyser des données de séries chronologiques de fluorescence avec une expérience limitée en microfluidique ou dans le développement de logiciels. Il permet d'obtenir time-lapse films de fluorescence des cellules de levure simples; extraire la taille des cellules pertinentes et les mesures d'expression; suivi curé et missions de la lignée, et analyser le comportement des cellules entières dans le temps en utilisant un dispositif de culture microflu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Y04C Plaque de perfusion de levure	CellAsic	Y04C-02
ONIX Plateforme de perfusion microfluidique	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Huile Objectif DIC	Zeiss	440762-9904-000
Caméra Cascade II EMCCD	Photométrie
Lampe à arc aux halogénures métalliques Lumen 200	PRIOR Scientific
Cube de filtre dichroïque triple-bandelle et ensemble de filtres d’excitation et d’émission	Chroma Technology Corp	set #89006	Utilisé pour YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
Contrôleur MAC 5000 et roues à filtres	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		La version 64 bits gère mieux les fichiers de données volumineux que la version 32 bits