Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Transplantation dans la chambre antérieure de l'oeil pour longitudinale, non-invasive

13.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/50466

⸱

10 mars 2013

Dans cet article

Résumé

Une nouvelle approche combinant la greffe intraoculaire et la microscopie confocale permet longitudinale, non-invasive imagerie en temps réel avec une seule cellule de résolution au sein des tissus greffés In vivo. Nous démontrons comment transplanter les îlots pancréatiques dans la chambre antérieure de l'œil de la souris.

Résumé

Intravitale imagerie est devenue un outil indispensable dans la recherche biologique. Dans le processus, les techniques d'imagerie nombreux ont été développés pour étudier différents processus biologiques chez les animaux non-invasive. Cependant, une limitation technique majeur existants modalités d'imagerie intravitale est l'incapacité de combiner non invasive, l'imagerie longitudinale avec des capacités de résolution unicellulaires. Nous montrons ici comment la transplantation dans la chambre antérieure de l'œil contourne cette limitation significative en offrant une plate-forme expérimentale polyvalente qui permet aux non-invasive, l'imagerie longitudinale avec une résolution cellulaire in vivo. Nous démontrons la procédure de transplantation chez la souris et de fournir des résultats représentatifs à l'aide d'un modèle avec pertinence clinique, à savoir transplantation d'îlots pancréatiques. En plus de permettre une visualisation directe dans une variété de tissus transplantés dans la chambre antérieure de l'œil, cette approche fournit une plate-forme d'éboulisn en effectuant des médicaments à long terme de suivi et de surveillance dans les tissus cibles. En raison de sa polyvalence, le tissu / la transplantation de cellules dans la chambre antérieure de l'œil non seulement les thérapies de transplantation avantages, elle s'étend à d'autres applications in vivo pour étudier les processus physiologiques et physiopathologiques tels que la transduction du signal et de cancers ou développer maladie auto-immune.

Introduction

Les progrès de la microscopie intravitale ont révélé des phénomènes physiologiques non prévus par les études in vitro 1. Cela met en évidence le défi de traduire les résultats obtenus par des méthodes in vitro conventionnelle dans l'animal vivant. Dans la dernière décennie, la visualisation des tissus chez les animaux vivants a été considérablement améliorée par les avancées technologiques en 2 modalités d'imagerie, 3, 4, 5, 6. Cela a suscité un besoin pour des approches d'imagerie in vivo avec une application possible dans des modèles animaux expérimentaux pour permett....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

La procédure suivante est réalisée dans le stéréoscope en 2 étapes, la première étape consiste à charger les îlots dans la canule et la seconde étape est la transplantation réelle dans l'ACE. Toutes les procédures effectuées sur des animaux ont été approuvés par les soins des animaux des établissements et des comités utilisation (IACUC) de l'Université de Miami.

1. Chargement en îlots Canule destinés à la transplantation

  1. Centre des îlots en boîte de culture en faisant tourner le plat dans les milieux rétrécissement.
  2. Débrancher le canule du «réservoir» et placer la canule et tubulure de raccordement sur une sur....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Il ya quelques paramètres qui définissent une «bonne» la transplantation. Une transplantation bonne est celle qui se déroule sans saignement lors de l'incision comme on peut le voir dans la vidéo. Le saignement est empêché / minimisée en pénétrant que la pointe du scalpel (aiguille) dans le ACE (figure 3a). Cela aidera également à éviter tout contact et à la perforation de l'iris. Il assurera également une petite incision qui va guérir très bien sans causer de trouble de la cornée au cours du te.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Îlots pancréatiques murins ont été isolés par digestion à la collagénase suivie d'une purification sur gradient de densité, comme décrit précédemment 33. Îlots isolés ont été cultivées pendant une nuit avant la transplantation. Bien que cela ne soit pas nécessaire, il est recommandé de permettre aux îlots de se remettre de la procédure d'isolement. Cela est essentiel si la transplantation est effectuée chez les receveurs diabétiques car elle garantit la transplantation d'îlots survivants / robuste.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

PO.B. est l'un des fondateurs de la société de biotechnologie Biocrine, qui va utiliser la chambre antérieure de l'œil comme une plate-forme de service commercial. AC est sur le brevet protégeant cette technologie.

Remerciements

Nous reconnaissons les Drs. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier et Daniel Nyqvist pour des discussions fructueuses. Nous remercions également Eleut Hernandez et Diego Espinosa-Heidmann pour l'assistance technique, et Mike Valdes et Margaret Formoso de l'aide pour l'enregistrement vidéo. Byron Maldonado a enregistré, édité et produit la vidéo finale. Soutien à la recherche a été fourni par la Fondation Diabetes Research Institute ( www.DiabetesResearch.org ), le NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 à MHA; NIH RO3DK075487 à AC; U01DK089538 à PO.B.). Soutien additionn....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Description / Commentaires
IsoTHESIA (isoflurane) Alimentation Buttler la santé animale 11695-6775-2 99,9% isoflurane / ml
Ketaset (kétamine HCL) Fort Dodge Animal Health 0856-2013-01 Alternative anesthésie injectable
Beprenex (buprénorphine HCL) Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd 12496-075-7-1 0,3 mg / ml
USP érythromycine onguent ophtalmique, 0,5% Akron 17478-070-35 Appliqué à titre prophylactique pour les yeux transplanté
Chlorure de sodium à 0,9% (Saline) Hospira Inc 0409-7983-03 Pour injection intraveineuse. Stérile
PBS Gibco 10010-023 1X. Stérile
CMRL moyenne 1066 Cellgro 98-304 CV- Complétée, la modification CIT. Support privilégié pour les îlots

Références

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Transplantation en chambre antérieureTransplantation d'îlots pancréatiquesImagerie de l'œil de sourisImagerie in vivo longitudinaleTechnique d'imagerie intravitaleProcédure de chargement de la canulepousse-seringue motoriséMéthode d'incision cornéenneGreffe de tissu oculaire