Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.
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Article de méthode
Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l'adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution
Dans cet article
Résumé
Résumé
La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L'élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l'adhérence cellulaire et l'accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d'améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure.
Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l'axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d'une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l'axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.
Introduction
La microscopie optique est l'un du système de formation d'image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l'exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques 1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser 2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d'imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous 3. Dans le même temps, grâce à l'étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l'échantillon mou ou invasi....
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Protocole
1. Configuration optique
Le système optique entier a été décrit précédemment 15. En bref, le système pinces optiques est basé sur une onde continue ytterbium (CW) fibre laser fonctionnant à 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulateur spatial de lumière (SLM) (LCOS-SLM, modèle X10468-07 - Hamamatsu) fait varier la phase du faisceau laser IR entrant pour commander la position de la tache de focalisation de piégeage sur la boîte de culture par ordinateur hologrammes générés. Les Blue-pinces logiciels (lien web sur la table de l'équipement) hologrammes générés librement disponibles projetées sur le modulateur spatial de lumière. L....
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Résultats
La cellule génère des forces de traction sur le substrat par ses points d'adhésion. Force générée par les éléments du cytosquelette sont en équilibre avec la force antagoniste du substrat de culture. Après lésion induite par laser de la neurite, une partie des câbles tendus de cytosquelette sont perturbés et leur tension équilibrée est libéré en raison de la force antagoniste de l'adhérence du substrat est éliminé. La tension libérée est partiellement diffusé sur les adhésions focales ne sont pas touchés, et le .......
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Discussion
Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l'adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d'adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d'adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité physique par lequ.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Alberto Guiggiani pour développer le système de contrôle en temps réel, Evelina Chieregatti et Hanako Tsushima des discussions perspicaces, Giacomo Pruzzo et Alessandro Parodi pour le développement de l'électronique et des logiciels personnalisés et Claudia Chiabrera et Marina Nanni pour leurs conseils d'expert et aide à la préparation de culture cellulaire.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RÉACTIFS | |||
| >Microsphères polymères, 4 &mu ; m, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| Laser IR | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | Laser à fibre d’ytterbium à ondes continues (CW) fonctionnant à 1064 nm, avec polarisation linéaire |
| Modulateur spatial de lumière | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Pince bleue Logiciel | Optics group, Université de Glasgow | Logiciel téléchargeable gratuitement | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Logiciel | téléchargeable gratuithttp://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 avec carte C5460SPL 6041 | Photo-diode à quatre quadrants pour mesurer x, y déplacement de la sonde piégée |
| Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode pour mesurer z déplacement de la sonde piégée | |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Laser UVA pulsé, longueur d’impulsion 400 ps |
| Modulateur optique acoustique | Olympus | MQ110-A3-UV, 355nm silice | |
| Microscope droit | Andor | BX51 | Équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 60, 0,9 NA |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Dispositif Peltier | Physic Instruments | QE1 Chauffage résistif avec chauffage à double canal TC-344B contrôleur | |
| Platine de microscope : platine micro+piézoélectrique | National Instruments | Trois platines linéaires M-126. CG1 portant un étage de nano-positionnement piézoélectrique à 3 axes séparé P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquisition de la position x, y, z de la sonde piégée et envoi de signaux de boucle de rétroaction à l’étage de microscope | |
| Machine | Système de boucle de rétroaction en temps réel, pour contrôler la position de l’étage, développé sur un ordinateur de bureau PC dédié |
Références
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et ....
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Réimpressions et autorisations
