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Une. Expansion des PNJ humaines (Figure 1)
- Renouer avec le stock congelé de PNJ humains de cerveau fœtal (Lonza, Walkersville, MD, USA) et de la culture leur en suspension dans flacons T-75 que neurosphères (figure 1A) en milieu neurobasal contenant des suppléments de prolifération, l'EGF (10 ng / ml) et FGF (10 ng / ml).
- Après 3 jours de culture, les neurosphères transférer à un tube de 15 ml et centrifuger à 500 rpm pendant 5 min.
- Jeter le surnageant laissant derrière lui ~ 100 ul de milieu au-dessus du culot de cellules et les transférer dans un tube Eppendorf. Un culot cellulaire 100 pi est assez de se scinder en deux T-75 flacons. Si moins, réduire le nombre de flacons que les cellules neuroprogenitor incapables de proliférer si diviser mince.
- On triture le culot avec un embout de 200 ul 50x tout en maintenant la pointe de 200 pi par rapport au fond du tube. Divisez la suspension cellulaire aussi en deux parties et les ajouter à 2 T-75 flacons (1-2 split), un pour la poursuitel'expansion et l'autre pour la différenciation.
- Continuer la culture des cellules neuroprogenitor d'expansion (premier flacon) en changeant le milieu tous les 4-5 jours jusqu'à ce que les neurosphères atteignent leur taille originale de 300 à 500 um. Changer le milieu par centrifugation (500 rpm, 5 min), jetez le support et ajouter un nouveau milieu.
2. Différenciation des PNJ humain dans une culture Neuron riche (Figure 2)
- Pour la différenciation des cellules dans un neuroprogenitor riche culture des neurones, placer une lamelle couvre-objet unique dans chaque puits d'une plaque à 24 puits et le manteau avec 100 ug / ml de poly-L-lysine en ajoutant 500 ul dans chaque puits. Incuber les boîtes pendant 30 minutes à température ambiante.
- Aspirer le-poly L-lysine solution et rincez la plaque avec de l'eau stérile.
- Ensuite, recouvrir les puits de la plaque avec 500 pi de 5 ug / ml de laminine de la souris et incuber pendant 30 min. Après incubation, laver les puits avec du PBS.
- 4 jours après splitting les cellules (étape 1.4), transférer les petites neurosphères dans le flacon étiqueté «pour la différenciation» dans les boîtes revêtues à une densité de ~ 500 neurosphères par puits d'une plaque de 24 puits.
- Après 6 heures, lorsque les neurosphères attachent à plat, retirez le support de la prolifération et ajouter du milieu de différenciation consistant en milieu neurobasal, supplément B27, NGF (20 ng / ml), le BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), et l'acide rétinoïque (2 uM).
3. Immunofluorescence de PNJ différenciés (Figure 3)
- Suite à la culture de cellules dans un milieu de neuroprogenitor différenciation neuronale pendant deux semaines, une culture de neurones riche est obtenu. Rincer les neurones une fois dans du PBS, puis les fixer à 4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Une fois fixé, rincer les cellules trois fois avec du PBS.
- Incuber les cellules avec un tampon de perméabilisation (5% de BSA et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS) à température ambiante pendant 60 min.
- Incuber les boîtes O / N à 4 ° C ina shaker avec la combinaison suivante d'anticorps polyclonaux et monoclonaux dans 3% de BSA dans du PBS: NeuN (1:250) et synapsine (1:250); acétylcholinestérase (1:500) et la synaptophysine (1:250); BDNF (1 : 500) et GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) et GFAP (1:1000).
- Laver trois fois les lamelles couvre-objet avec du PBS, puis de les incuber avec des anticorps anti-lapin-Cy3 et des anticorps secondaires anti-souris-FITC à la température ambiante dans l'obscurité pendant 90 min. Après l'incubation, les lamelles laver trois fois avec du PBS.
- Placer 10 ul de milieu de montage sur une lame de verre, prendre la lamelle de la boîte de culture avec une pince, et placez-le à l'envers sur le support de montage. Doucement, essuyer tout support de montage excès et sceller les bords avec du vernis à ongles.
- Examiner les neurones immunocolorées dans un microscope à fluorescence.
4. Microdissection laser de neurones (Figure 4)
- Différencier les PNJ dans une culture de neurones riches sur PEN lame de membranes recouvertes de poly-L-lysine et de laminine de souris en suivant les procédures décrites pour la figure 2.
- Effectuez toutes les étapes ultérieures dans des conditions RNAse-libres.
- Colorer les cultures en utilisant HistoGene Stain (Arcturus) pour visualiser les cellules.
- Trouver les zones de populations neuronales purs dépourvus des astrocytes en utilisant l'image de feuille de route de la diapositive entière avec le système Veritas LCM. Marquez les neurones en utilisant les outils de dessin.
- Effectuer capture laser de ces zones à l'aide de précision contrôlé par ordinateur et d'automatisation d'un processus en deux étapes. Tout d'abord, IR (infrarouge) est tiré à plusieurs endroits avec un réglage de la puissance du laser de 70 mW et une impulsion de 2500 microsecondes pour obtenir la membrane joindre à la capsule. Ensuite, la zone marquée est excisée à l'aide d'un outil de coupe UV à un réglage bas de niveau de 10 mV.
- Combinaison de ces procédés capture sélectivement les zones marquées de la membrane PEN sur CapSure LCM macro bouchons. Lorsque le capuchon est levé, la membrane avec le neurons adhère à la capsule.
- Isoler l'ARN total à partir d'échantillons LCM en utilisant un kit d'isolement PicoPure ARN (Arcturus) et traiter avec de la DNase.
- Amplifier l'ARN isolé en utilisant le kit d'amplification RiboAMP ARN en suivant les instructions du kit.
- Effectuer l'analyse en temps réel RT-PCR utilisant des sondes TaqMan pour détecter neurofilaments humaine chaîne lourde (hNFHc).
Abréviations:
AD, la maladie d'Alzheimer; BDNF, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau; CREB, protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMP cyclique; DBC, dibutyryl AMP cyclique, l'EGF, le facteur de croissance épidermique; FGF, facteur de croissance fibroblastique, GFAP, protéine acide fibrillaire gliale, LCM, laser microdissection, NGF, facteur de croissance nerveuse; PNJ, neuroprogenitor cellule; PEN, polyéthylènenaphtalate.