Trypsine protocole Digest pour analyser la vascularisation rétinienne d'un modèle de souris

Résumé

Trypsine digest est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour analyser la vascularisation rétinienne. Ce manuscrit décrit la méthode en détail, y compris les modifications clés pour optimiser la technique et retirer le tissu non vasculaire tout en préservant l'architecture d'ensemble des navires.

Résumé

Trypsine digest est la méthode de référence pour analyser la vascularisation rétinienne ^1-5. Il permet de visualiser l'ensemble du réseau de vaisseaux complexes tridimensionnels sanguins et des capillaires rétiniens en créant une plate-montage en deux dimensions des canaux vasculaires interconnectés après digestion des composants non-vasculaires de la rétine. Cela permet d'étudier diverses modifications pathologiques vasculaires, tels que les micro-anévrismes, la dégénérescence capillaire et anormal endothéliales des ratios pericyte. Cependant, la méthode est techniquement difficile, surtout chez la souris, qui sont devenus le modèle animal le plus largement disponible pour étudier la rétine en raison de la facilité de manipulations génétiques ^6,7. Dans l'oeil de la souris, il est particulièrement difficile de supprimer complètement les composants non-vasculaires tout en conservant l'architecture globale des vaisseaux sanguins de la rétine. À ce jour, il ya une pénurie de littérature qui décrit la technique de digérer la trypsine en détail in la souris. Ce manuscrit fournit une méthodologie détaillée de la trypsine digest dans la rétine de souris, étape par étape, tout en fournissant des conseils sur les étapes de dépannage difficiles.

Introduction

Visualiser la vascularisation de la rétine est une approche extrêmement important de disséquer les mécanismes de diverses maladies oculaires comme la rétinopathie diabétique. Il permet d'évaluer les anomalies vasculaires premières, y compris les micro-anévrismes, la dégénérescence et la perte capillaire pericyte ^8,9. À ce jour, il ya eu plusieurs techniques mises au point pour analyser la vascularisation rétinienne. Perfusion de divers colorants a été utilisé pour mettre en évidence les vaisseaux, mais tous ont partagé les mêmes limites. Injection met rarement toute la vascularisation rétinienne moins donné à une haute pression, ce qui risque de rupture et d'endommager les navires ^1. Immunocoloration de l'endothélium vasculaire avec fluorophore marqué G isolectine B4 (Alexa Fluor 594 conjugué; I21413; Invitrogen; dilution 1:100) et les supports plats rétine peut mettre en évidence l'architecture globale des vaisseaux, mais sans visualisation détaillée des capillaires, les membranes basales et pericytes . Il a été noté parFriedenwald que les navires peuvent être mis en évidence par coloration plate-monts de rétine avec de l'acide périodique Schiff (PAS) ou hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration ^10. Cependant, la coloration était non spécifique aux vaisseaux et a souligné le tissu non vasculaire ainsi, il est difficile de différencier les vaisseaux. Dans les années 1960, Cogan et Kuwabara développé la technique la trypsine digest qui a rendu plus facile de visualiser la vascularisation rétinienne en digérant les composantes non vasculaires de la rétine ^1. Depuis ce temps, la trypsine digest est devenue la méthode de référence dans l'analyse de la vascularisation de la rétine ^2-5. Cependant, il est important de noter que d'autres alternatives techniques pour isoler le système vasculaire ont été décrits. L'utilisation de lyse osmotique a été utilisée pour isoler le système vasculaire et permettre des études biochimiques du tissu ^11,12, mais la procédure n'a pas été utilisé comme méthode principale pour l'étude anatomique. Procédé d'impression de tissu estutilisée pour isoler de larges segments de microvascularisation et permet la possibilité d'étudier l'architecture électrotonique de la vascularisation ^13. En théorie, cette technique pourrait également être utilisée pour étudier les changements anatomiques, comme la qualité des vaisseaux est élevé. Cependant, il est seulement capable d'isoler les segments de l'ensemble du réseau vasculaire. Bien que ces méthodes ne peuvent pas remplacer la trypsine digérer, il est important de noter qu'ils ont des avantages et des inconvénients et sont complémentaires à cet égard.

La méthode digest trypsine est techniquement difficile et il est difficile de performer de façon constante ^6,7. En outre, il a été noté que la trypsine digest est particulièrement difficile sur un modèle de souris, en particulier si l'on veut préserver l'architecture vasculaire global de la rétine ^6,7. Les défis incluent (1) sur-digestion de la rétine qui entraîne une perte à la fois du système vasculaire ainsi que le tissu non vasculaire, (2) sous-digestion, exigeantdissection étendue mécanique qui pourrait à son tour conduire à des lésions de la chambre de cuve (3), une mauvaise séparation des tissus non vasculaires du système vasculaire qui conduit à une coloration non spécifique. Plusieurs manuscrits ont mis en évidence ces défis, mais aucune n'a fourni un protocole détaillé et cohérent pour les surmonter ^14,15. Ce manuscrit va introduire une méthodologie étape par étape décrivant la technique pour effectuer la trypsine digest sur la souris et le rat rétines avec des conseils spécifiques sur la manipulation des étapes particulièrement difficiles. Un aperçu schématique est illustré à la figure 1.

Protocole

1. Préparation rétinienne

1. Énucléer l'oeil de la souris. En utilisant une main, ouvrir les paupières de sorte que l'œil est visible. Avec l'autre main, à l'aide d'une pince courbes (courbes vers le haut), appliquer une pression sur les aspects supérieurs et inférieurs de l'orbite jusqu'à ce que les dépasse globe. Fermez doucement forceps à la partie postérieure de l'œil et de soulever dans un mouvement continu pour énucléer l'œil.
2. Corrigez les yeux avec 10% de formol tamponné neutre pendant au moins 24 heures.
3. Lieu oeil dans une solution de PBS dans une petite boîte de Pétri.
4. Disséquer rétine soigneusement sous un microscope, en prenant soin d'éviter de provoquer de grosses larmes. Faire une coupe initiale dans la cornée avec des ciseaux de dissection. Puis, tout en maintenant la zone de coupe avec des pinces droites, utilisez des ciseaux pour couper le long de la frontière de la cornée et la sclérotique de retirer la cornée. En utilisant des pinces courbes et droites fines, détachez soigneusement la sclérotique et la choroïde loin de la rétine vers le nerf optique. Cette étape exige de la patience commelibérant rapidement la rétine peut entraîner des larmes. Retirez l'objectif et tout excédent iris et les débris de la rétine ^16.

2. Eau lave

1. Lieu rétine dans un plat de 24 puits et couvrir d'eau (environ 500 pi, filtrée avec au moins un filtre de 45 um).
2. Changez l'eau toutes les 30 min-1 heure, au moins 4-5 fois.
3. Laissez sécher une nuit dans de l'eau avec agitation douce à température ambiante.

Remarque: Les étapes de lavage sont très importants car ils permettent de séparer les couches de la rétine de neurones à partir des vaisseaux sanguins.

3. Trypsine Digest

1. Enlevez l'eau et de la rétine incuber dans une solution de 3% de trypsine (Difco 1:250) dans 0,1 M de tampon Tris (pH 7,8) à 37 ° C avec douceur à aucune secousse. Trypsine digestion est terminée lorsque le tissu commence à montrer des signes de désintégration (environ 1,5 heures).
   Note: Eviter d'agiter rapidecar cela peut endommager le système vasculaire.
   
2. Soigneusement, une pipette à la trypsine dans un puits séparé en utilisant un microscope pour éviter de toucher la rétine. Cet excès de trypsine peut être utilisé plus tard, lors de la manipulation des vaisseaux sous le microscope, à l'étape 4.3.

4. Séparer le système vasculaire

1. Ajouter de l'eau filtrée à la rétine. Ensuite, tenter de décoller la membrane limitante interne avec une pince, en utilisant des ciseaux si nécessaire. Agiter avec une légère agitation pendant 5 min. Soigneusement, une pipette à l'eau sous le microscope pour éviter d'endommager la rétine.
2. Répétez lavages à l'eau (pendant 5 minutes chacun) pour aider à libérer le réseau de vaisseaux du tissu rétinien adhérente. lavages à l'eau sont terminés quand il ya peu ou pas de débris restant dans l'eau après le lavage.
3. Manipulations soigneuses sous un microscope de dissection sont maintenant nécessaires pour libérer davantage le réseau de vaisseaux. Voici quelques techniques utiles, qui peuvent être utilisés dans l'ordre ou individually pour atteindre le résultat souhaité en fonction des préférences technique:
   1. Avec une pipette 200 pi, une pipette soigneusement l'eau de haut en bas à côté de bateaux, l'eau soufflant à bateaux, provoquant une agitation douce.
   2. Utilisation de la pipette 200 ul, Pipette la trypsine de haut en bas pour aider les parois de manteau de la pipette. Ensuite, ATTENTIVEMENT pipette le réseau de vaisseaux tout haut et en bas une fois pour aider à briser le tissu non vasculaire.
      Note: Le centrage de la pointe de la pipette au niveau du nerf optique plutôt que sur les bords du réseau vasculaire peut également empêcher la vascularisation de coller à la pointe.
      
   3. Soulevez doucement vasculaire avec une pince fine hors de l'eau pour déloger les composants non-vasculaires.
   4. Si les étapes précédentes ne fonctionnent pas, ajoutez la trypsine de la rétine pour aider à briser le tissu et incuber à 37 ° C pendant plusieurs minutes. Ensuite, retirez la trypsine et répétez les étapes 4.1-4.3.

Note: Assurez-vous de bien enrober tous les instruments qui entrent en contact avec les navires de la trypsine (par exemple la pointe de pipette, forceps). Cela permettra d'éviter l'adhérence de la vascularisation de l'équipement.

5. Visualiser la vascularisation

1. Déposer une goutte d'eau sur une lame propre. Avec une pipette ou une pince 200 pi, transférer les vaisseaux digérés dans l'eau. Assurez-vous que la plate-mount vasculaire est déplié. La tension superficielle de l'eau permet de déplier le réseau vasculaire maintenant diaphane. Si le tissu ne se déroule pas, ajouter de l'eau et secouez doucement la lame pour faciliter le déroulement.
2. Retirer l'excès d'eau très lentement par la pipette ou en utilisant une serviette en papier.
3. Laisser les lames sécher complètement.
4. Colorer diapositives via le protocole approprié avec soit PAS / hématoxyline ou H & E tache.
   Note: PAS / hématoxyline est utile pour identifier paroi de la cuve et des noyaux cellulaires, H & E est utile pour da démonstration de RBC ainsi.
   
5. Déshydrater et monter (Moyen Permount montage).

Résultats

Le produit final d'une procédure réussie est une plate-montage de l'ensemble du réseau de la vascularisation rétinienne de la souris, avec l'architecture maintenu, colorées avec soit PAS / hématoxyline ou H & E, comme indiqué dans les figures 2-4. Effacer la différenciation des cellules endothéliales et des péricytes peut être considéré comme le montre la figure 3. Dans la rétine, les noyaux des cellules endothéliales sont de forme ovale ou allongée et se trouvent entièr...

Discussion

Trypsine digest est une méthode standard pour évaluer la vascularisation de la rétine. Malheureusement, il est techniquement difficile et peut entraîner des taux de perte de spécimen s'il n'est pas effectué correctement. En outre, la procédure est particulièrement difficile chez la souris, ce qui peut limiter l'application de cette technique dans les modèles animaux génétiques couramment utilisés de maladies oculaires. Ce document fournit des conseils sur la façon d'exécuter de manière efficace et cohére...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
10 % neutre buffered formalin	Fischer	Scientific SF100-4
Trypsine (1:250)	Amresco	0458-50G	Faire 3 % de trypsine dans 0,1 M Tris
TRIZMA base	Sigma	T1503-1KG	Créer 0,1 M Tris Buffer (pH 7,8 @ 37 ° ; C)
TRIZMA	Sigma	T3253-500G
Steritop bouteille sous vide stérile	Millipore	SCGPS05RE	Créer de l’eau
EQUIPMENT
Dissecting			microscope qui permet une bonne visualisation de la rétine est adéquat. (10x est suffisant avec une distance de travail de 24 mm)
Ciseaux droits	Fine Science Tools	15024-10	Tranchant : 8 mm ; Diamètre de la pointe : 0,2 mm ; Pince droite de 10 cm
(Inox)	Dumont #5	11252-20	Pointe de biologie ; 0,05 x 0,02 mm ; 11 cm
Forcepts incurvés (Dumostar)	Dumont #7	11297-10	Pointe de biologie ; 0,07 x 0,04 mm ; 11,5 cm
Agitateur métabolique Dubnoff Incubateur	Precision Scientific	BDG59442	Shaker en option
	353047		24 puits
	VWR	82027-132