Caractérisation des réponses inflammatoires au cours de la colonisation intranasale avec Streptococcus pneumoniae

Résumé

La colonisation du nasopharynx murin avec Streptococcus pneumoniae et l’extraction ultérieure des cellules adhérentes ou recrutées sont décrites. Cette technique consiste à rincer le nasopharynx et la collecte du liquide à travers les narines et est adaptable à diverses lectures, y compris la quantification cellulaire différentielle et l’analyse de l’expression de l’ARNm in situ.

Résumé

La colonisation nasopharyngée par Streptococcus pneumoniae est une condition préalable à l’invasion des poumons ou de la circulation sanguine¹. Cet organisme est capable de coloniser la surface muqueuse du nasopharynx, où il peut résider, se multiplier et éventuellement surmonter les défenses de l’hôte pour envahir d’autres tissus de l’hôte. L’établissement d’une infection dans les voies respiratoires normalement inférieures entraîne une pneumonie. Alternativement, la bactérie peut se disséminer dans la circulation sanguine provoquant une bactériémie, qui est associée à des taux de mortalité élevés², ou bien conduire directement au développement d’une méningite à pneumocoque. Comprendre la cinétique de la colonisation nasopharyngé et les réponses immunitaires à celle-ci est un aspect important des modèles d’infection à S. pneumoniae.

Notre modèle murin de colonisation intranasale est adapté des modèles humains³ et a été utilisé par plusieurs groupes de recherche dans l’étude des réponses hôte-pathogène dans le nasopharynx^4-7. Dans la première partie du modèle, nous utilisons un isolat clinique de S. pneumoniae pour établir une colonisation bactérienne auto-limitante qui est similaire aux événements de portage chez les adultes humains. La procédure décrite ci-dessus implique la préparation d’un inoculum bactérien, suivie de l’établissement d’un événement de colonisation par la livraison de l’inoculum par l’intermédiaire d’une voie intranasale d’administration. Les macrophages résidents sont le type de cellule prédominant dans le nasopharynx pendant l’état stable. Typiquement, il y a peu de lymphocytes présents chez les souris non infectées⁸, mais la colonisation muqueuse conduira à une inflammation de bas à haut grade (en fonction de la virulence de l’espèce bactérienne et de la souche) qui entraînera une réponse immunitaire et le recrutement ultérieur des cellules immunitaires de l’hôte. Ces cellules peuvent être isolées par un lavage du contenu trachéal à travers les narines, et corrélées à la densité des bactéries de colonisation pour mieux comprendre la cinétique de l’infection.

Protocole

Avant de commencer: toutes les étapes sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (ESB) de niveau 2 (BSL2) de niveau 2, sauf indication contraire. Veuillez vous assurer que vous avez obtenu l’approbation appropriée en matière de biorisques pour l’utilisation d’agents pathogènes bactériens infectieux conformément aux lignes directrices de l’établissement avant le début des expériences. De plus, veuillez vous assurer que vous disposez de tous les matériaux et réactifs nécessaires pour effectuer la procédure préparée au préalable. Les souris utilisées dans ces expériences ont inclus des souris femelles C57BL/6 des laboratoires Jackson, Charles River ou Taconic et étaient âgées de 10 à 14 semaines (bien que nous n’ayons trouvé aucune différence significative selon le sexe dans la cinétique de la clairance ou de l’infection de colonisation nasale). Toutes les souris utilisées dans ces expériences ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques, et étaient exemptes de virus courants (LCMV, MNV, MPV, réovirus ECTV et autres) bactéries(p. ex. H. pylori)et parasites(p. ex. oxyures, ectoparasites) par des tests d’échantillons fécaux ainsi que par une évaluation anatomique fréquente de souris sentinelles co-abris dans les chambres de leurs installations. Lors de la réalisation de ces expériences, nous vous recommandons d’utiliser des souris témoins âgées d’au moins 10 à 12 semaines et d’au plus 6 mois. Les souris plus jeunes ou plus âgées que cette tranche d’âge sont plus sensibles à une plus longue durée de portage nasopharyngé et à une probabilité accrue de diffusion de l’infection. Le fond de souris est une autre considération importante qui peut avoir un impact sur les résultats d’une expérience de colonisation, car plusieurs groupes ont démontré que les souris de différents milieux génétiques ont des susceptibilités différentes à la souche^9,10de S. pneumoniae D39 (sérotype 2). S. pneumoniae n’est pas un agent pathogène murin naturel et son seul réservoir naturel est le nasopharynx humain. La transmission se produit par l’intermédiaire de gouttelettes respiratoires, et comme les souris ne produisent pas de sécrétions respiratoires, les souris individuelles ne peuvent pas transmettre la bactérie à d’autres souris, il n’y a donc aucune préoccupation pour la transmission de souris à souris¹¹. Pour un aperçu visuel des procédures décrites dans ce manuscrit, veuillez consulter la figure 1.

1. Préparation de la culture de S. pneumoniae

1. Inoculer 5 ml de gélose tryptique au soja pour la croissance en suspension de Streptococcus pneumoniae.
2. Culture dans des conditions statiques à 37 °C dans 5 % de_CO2 jusqu’à ce que l’inoculum bactérien atteigne la phase logarithmique de croissance avec une densité liquide correspondante de^{10 8} UFC/ml déterminée par un odomètre réglé à 600 nm. La lecture exacte correspondant à cette UFC variera en fonction de la souche bactérienne spécifique sélectionnée; pour la plupart des souches de S. pneumoniae, cela correspond à une gamme de_{DO 600} de 0,45 à 0,55. Typiquement, les souches de S. pneumoniae en culture liquide se développeront à cette densité dans les 1,5-2,5 heures dans les conditions recommandées, sans avoir besoin de sous-culture. La culture ne doit pas être autorisée à envahir (au-delà d’une lecture OD de 0,75) car cela représente le point auquel les bactéries ne sont plus en phase logarithmique de croissance et subissent une autolyse étendue.
3. Chaque souris sera inoculée avec environ 10⁷ bactéries. Par conséquent, pour chaque 9 souris à coloniser, pipetter 1 ml d’inoculum dans un tube d’Eppendorf et tourner à 15 000 x g pendant 1 min. Une pastille blanchâtre doit être visible. Retirez le surnageant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille et de ressusciter les bactéries dans 100 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), augmentant ainsi la concentration à 10⁹ UFC/ml. À ce stade, les bactéries doivent rester viables, mais ne se répliqueront pas facilement.
4. Si vous utilisez plusieurs aliquotes, combiner en un seul tube pour contrôler les légères variations de densité bactérienne entre les échantillons.
5. Gardez les bactéries sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être inoculées, pendant un maximum de 1 heure.
6. Pour obtenir un nombre exact de bactéries, effectuez une série de dilutions en série logarithmique en commençant par un inoculum bactérien soigné. Diluer en série 10 fois, en ajoutant 10 μl de PBS stérile à 90 μl.
7. Plaquer 3 gouttes d’échantillons de 10 μl de dilutions^10-5 - 10-9, plus un contrôle de la contamination pbs uniquement, sur des sections étiquetées séparément de la plaque de gélose au soja tryptique (TSA) complétées par 5% de sang de mouton(Figure 2). S’assurer que les pointes de pipette sont modifiées pour chaque étape de dilution d’une concentration plus élevée de UFC à une concentration plus faible d’UFC afin d’éviter de transporter des bactéries en excès et d’augmenter la variabilité des résultats. Les plaques de gélose au sang humain (HBA) peuvent également être utilisées à la place de la TSA. Étant donné que de nombreuses souches de S. pneumoniae sont résistantes à la néomycine (de 5 à 20 μg/ml), cet antibiotique peut également être ajouté au milieu gélosé de choix pendant la phase de préparation de la plaque. Cela facilite le dénombrement car il élimine les bactéries non résistantes. La sensibilité aux antibiotiques de chaque souche doit être testée à l’avance afin de déterminer la concentration optimale d’antibiotique à utiliser pour chaque souche bactérienne.
8. Laisser sécher pendant 15-30 min à découvert, puis couvrir les plaques et placer à l’envers dans un incubateur bactérien réglé à 37 °C et 5% de_CO2. Cultiver des colonies bactériennes sur la plaque pendant 24 heures.
9. Déterminer le nombre d’unités formant des colonies et leur concentration correspondante. D’après les déterminations de la valeur de do_600, la concentration doit se situer dans la plage de 1-4 x^{10 9} UFC/ml. S. pneumoniae colonies doit apparaître sous forme de petites colonies circulaires de couleur beige jaunâtre, avec une petite dépression au centre leur donnant un aspect semblable à un beignet (Figure 3).

2. Colonisation intranasale murine

1. Retenir les souris en les plaçant dans un appareil de retenue de souris (un tube Falcon modifié de 50 ml avec la pointe coupée pour créer une ouverture) en les fixant par la base de leur corps avec le pouce de sorte que leur nez émerge juste de l’extrémité conique de l’appareil de retenue(Figure 4). L’utilisation de cet appareil permet l’immobilisation de la tête de la souris et la ségrégation de ses narines d’une manière qui minimise les mouvements et empêche les tentatives de l’animal demastiquer la pointe de la pipette, permettant l’administration complète de l’inoculum. Alternativement, les souris peuvent être immobilisées par des éraflures au cou et une contention manuelle. Nous ne recommandons pas l’anesthésie des animaux avant l’inoculation intranasale. L’administration de l’inoculum à des animaux sous anesthésie entraîne une partie de l’inoculum qui se propage aux poumons^12,13.
2. À l’aide d’une pipette P10 ou P20, inoculer chaque souris en déposant 10 μl de la culture préparée, en la répartissant uniformément entre les deux narines (laisser l’inoculum s’égoutter dans le nez en pulsant l’inoculation progressivement, en prenant le temps pour les souris d’inhaler l’inoculum). Pour obtenir l’administration complète de l’inoculum, suspendez l’administration à tout moment où la souris commence à bouger son nez de manière excessive. L’inoculum entier ne peut pas être injecté dans les narines car les souris peuvent en expulser certains par le nez pendant l’expiration; cependant, comme la quantité expulsée a tendance à être minuscule et que l’inoculum contient une quantité extrêmement élevée de bactéries, cela n’affecte pas de manière significative la charge bactérienne colonisatrice. De plus, la surface disponible pour la colonisation dans la muqueuse nasopharyngée est limitée et, par conséquent, nous et d’autres avons constaté que la dose recommandée de 10⁷ est suffisante pour obtenir des niveaux constants de bactéries chez toutes les souris, ce qui entraîne une variabilité minimale des quantités initiales de bactéries coloniseuses^14,15 .
3. Pesez les souris si vous utilisez des indicateurs de poids dans le cadre de votre surveillance du point final. Surveillez les souris toutes les 12 à 24 heures pour les symptômes cliniques, y compris la léthargie, la fourrure ébouriffée et la perte de poids. Les souris ne présenteront généralement pas de symptômes de maladie avant 3-5 jours après la colonisation, et ceux-ci seront précédés d’une perte de poids qui peut en moyenne autour de 5% du poids corporel total par jour. Au fur et à mesure que les souris tomberont de plus en plus malades, elles assumeront des postures voûtées et montreront une diminution de l’activité et une diminution de la réactivité à la stimulation, y compris la manipulation. À ce stade, la maladie est généralement révélatrice d’une septicémie et/ou d’une pneumonie et sera probablement terminale, bien que les souris puissent être traitées avec 1 ml de solution saline sous-cutanée par jour pour améliorer les résultats. Les souris survivantes devraient commencer à montrer une amélioration après le jour 7 après la colonisation, comme en témoigne la stabilisation du poids suivie d’un gain de poids, bien que différentes souches de S. pneumoniae puissent induire la maladie plus rapidement et entraîner la progression des symptômes cliniques selon une ligne de temps différente. Veuillez consulter la figure 5 pour un résultat représentatif du poids suivi chez les souris colonisées avec la souche P1547.

3. Prélèvement d’échantillons de lavage nasal

Avant de commencer: préparer des aiguilles canulées à l’aide de seringues de 1 ml coiffées d’aiguilles biseautées de 26 3/8 G. Couper des morceaux de 2,5 cm de tubes en polyéthylène PE20 d’un diamètre intérieur de 0,38 mm, en veillant à ce que chaque extrémité ait une pointe biseautée. À l’aide d’une pince, faites glisser un morceau de tube en polyéthylène PE20 de 2,5 cm de long (diamètre intérieur de 0,38 mm) sur la pointe de l’aiguille, en évitant de perforer le côté du tube. Les aiguilles canulées peuvent être conservées dans de l’éthanol à 70% jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires.

1. Euthanasier des souris expérimentales. Car la dislocation cervicale peut potentiellement endommager la trachée, cette méthode d’euthanasie doit être évitée. Notre méthode préférée est l’anesthésie isoflurane suivie d’une exsanguination, cependant, assurez-vous de suivre les directives institutionnelles lors de la sélection du mode d’euthanasie.
2. En utilisant de l’éthanol aqueux à 70%, stérilisez la fourrure superoantérieure de l’animal, en particulier le cou, en prenant soin d’empêcher l’éthanol d’accéder aux narines.
3. Faites une seule coupe longitudinale le long de la ligne médiane du cou de l’animal et deux coupes horizontales à chaque extrémité, créant une ouverture pour envisager la trachée.
4. Pelez soigneusement la peau de chaque côté, révélant le tissu du cou en dessous.
5. La trachée doit être visible, entourée de muscles longitudinaux de chaque côté. Coupez-les soigneusement pour fournir une vue claire de la trachée elle-même, en prenant soin de ne pas couper la vascularisation environnante.
6. Si la vascularisation a été coupée et que du sang est présent, avant de procéder, laissez le saignement s’arrêter, puis nettoyez la zone plusieurs fois en distribuant du PBS stérile et en utilisant de la gaze stérile pour absorber doucement l’excès d’humidité dans la zone.
7. Une fois que la trachée est correctement exposée, faire une coupe transversale et semi-lunaire dans la trachée à mi-hauteur (Figure 6).
8. Prélever 1 000 μl de PBS stérilisé dans une aiguille canulée préalablement préparée.
9. Insérez la canule dans la trachée vers le nez, en maintenant le bord biseauté pointant vers le bas pour faciliter l’insertion(figure 7). Une fois l’aiguille en place, faites-la pivoter de 180° et sondez doucement vers le haut jusqu’à ce que vous ressentiez une résistance à la lumière.
10. Place Eppendorf désignée pour le prélèvement d’échantillons juste sous le nez de la souris.
11. Tester le placement correct de l’aiguille en distribuant une quantité minimale (~ 20 μl) de liquide de lavage PBS - une goutte de liquide devrait se former autour des narines de la souris; si c’est le cas, passez à l’étape 3.13).
12. Si le PBS de test émerge directement de la bouche de l’animal, tirez la canule en arrière et repositionnez-la en sondant à nouveau doucement vers l’avant jusqu’à ce qu’une très légère résistance soit ressentie - veillez à ne pas pousser la canule trop loin au-delà de cette résistance, car vous la déplacerez au-delà du palais nasal et à travers la cavité buccale.
13. Distribuez rapidement le contenu de l’aiguille pour aider à déplacer et à recueillir la quantité maximale de cellules - le contenu doit s’écouler à travers les narines de la souris et dans le tube de collecte. Placez l’échantillon immédiatement sur la glace.
14. Pour prélever des échantillons pour l’analyse de l’ARN, répétez les étapes 3.8-3.13) à l’aide d’une aiguille canulée contenant 500 μl de tampon de lyse de l’ARN sur la même souris. Cela permettra de prélever des échantillons de lysat dans les populations cellulaires restantes, en grande partie composées de l’épithélium muqueux nasopharyngé, car les cellules nonadherentes auraient dû être retirées après le lavage initial du PBS. Veuillez noter que le tampon de lyse de l’ARN désassudera l’épithélium et détruira les tissus environnants, il faut donc prendre soin d’éviter tout contact avec des organes tels que les poumons, si la rétention de ces tissus est souhaitée. Une fois prélevé, placez l’échantillon dans un tampon de lyse de l’ARN directement sur de la glace carbonique pour qu’il gèle. Une fois dans le tampon de lyse, les échantillons peuvent être conservés conformément aux instructions du fabricant et sont généralement stables à -70 °C pendant plusieurs mois.

4. Détermination de la charge bactérienne dans le nasopharynx

1. Quantifier les bactéries en préparant une série de dilutions en série pour chaque échantillon de lavage nasal murin. En général, on peut s’attendre à ce que la charge bactérienne soit comprise entre 0 et^{10 4} UFC, donc effectuer trois dilutions en série 10 fois. Ajouter 10 μl de l’échantillon de lavage nasal soigné (100 UFC/ml) au premier tube à une concentration de 10^-1 UFC/ml. Vortex soigneusement.
2. Diviser la plaque bactériologique en quadrants et étiqueter les quadrants chacun avec un membre de la série de dilution (10⁰-10^-3 UFC/ml). Plaquez 3 gouttes d’échantillons de 10 μl des 3 dilutions et l’échantillon soigné sur des plaques tryptiques de gélose au soja complétées par du sang de mouton à 5%, comme à la figure 2.
3. Laisser sécher pendant 15-30 min à découvert, puis couvrir les plaques et les placer à l’envers dans un incubateur bactérien avec des conditions optimales pour la croissance bactérienne (généralement 37 °C et 5% de_CO2).
4. Faire pousser des colonies bactériennes sur la plaque pendant 18-24 heures.
5. Déterminer le nombre de bactéries colonisantes en faisant la moyenne des colonies formées sur la plaque pour chaque dilution(figure 3). La figure 8 montre la densité bactérienne pendant différents points temporels, déterminés par la culture de lavages nasaux, chez des souris colonisées avec 3 souches différentes de S. pneumoniae pendant jusqu’à 21 jours.

5. Préparation d’échantillons pour le cytomètre de flux

Avant de commencer : Préparer un mélange d’anticorps. Pour la quantification des populations de leucocytes, nous recommandons le mélange suivant aux dilutions spécifiées : PE-Ly6G (clone 1A8, 1 μg/ml), FITC-Ly6C (clone AL-21,1 μg/ml), eFluor 450-CD45 (clone 30-F11, 2,67 μg/ml), APC-F4/80 (clone PM8 RUO, 0,67 μg/ml), PerCP-Cy5.5-CD11c (clone N418 RUO, 0,5 μg/ml), PE-Cy7-CD11b (clone M1/70, 0,33 μg/ml), Alexa Fluor 700-CD3 (clone 1782, 4 μg/ml), eFluor 605NC-CD4 (clone GK1.5, 6,67 μg/ml). Veuillez noter que ce mélange est 2x concentration (voir étape 5.5). Tous les anticorps doivent être dilués dans un tampon DE LAVAGE FACs (0,5% de sérum de veau fœtal, EDTA 2mM, 0,1% d’azide de sodium dans du PBS) qui doit également être préparé à l’avance. Dans un mélange d’anticorps témoins correspondant à l’isotype, idéalement du même fournisseur que les anticorps marqués et aux mêmes concentrations que les anticorps spécifiques, il faut préparer. Les échantillons traités avec les anticorps de contrôle d’isotype fonctionneront comme le témoin négatif. Toute fluorescence observée dans les échantillons traités avec les anticorps de contrôle d’isotype doit être considérée comme un fond.

1. Prechill une centrifugeuse capable de faire tourner 1,5 ml de tubes Eppendorf à 4 °C.
2. Échantillons de lavage nasal par centrifugeuse à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Pipette soigneusement surnageant et réservez. Remarque: en raison de la petite quantité de cellules dans le nasopharynx, le culot cellulaire ne sera pas visible à moins qu’il n’y ait une contamination indésirable des globules rouges, qui sera rouge vif. Si cela se voit, l’échantillon doit être jeté.
3. Ressusciter l’échantillon dans 50 μl de Fc? Anticorps RIIb/CD16-2 (2.4G2) (qui lie les récepteurs Fc et réduit la liaison aux anticorps non spécifiques) dans le tampon de lavage des FACs à une concentration de 4 μg/ml.
4. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 30 min.
5. Ajouter 50 μl de mélange d’anticorps fluorescents concentrés 2x préparés à l’échantillon. Mettez de côté un échantillon représentatif de chaque groupe expérimental pour agir comme un contrôle d’isotype. Ajouter le mélange d’anticorps isotypes à cet échantillon au lieu du mélange de taches.
6. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 1 heure.
7. Échantillons de centrifugeuses à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et le ressusciter dans 200 μl de PBS.
8. Répétez l’étape 5.7.
9. Après le deuxième lavage, centrifuger à nouveau des échantillons à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
10. Réinsérer dans le PBS (si l’échantillon est exécuté immédiatement) ou dans du paraformaldéhyde à 2% (si les échantillons sont en cours d’exécution 1-3 jours après la coloration).
11. Lors de la cytométrie de flux, prélever le maximum d’événements par échantillon ou jusqu’à ce que l’échantillon entier ait été aspiré. Chez les jeunes souris non infectées, en bonne santé, ce sera aussi peu que 1 000-2 000 événements au total; Au cours d’un événement de colonisation bactérienne, ce nombre peut être multiplié par plus de 2 à 5 en fonction de l’état de la maladie chez l’animal et de facteurs tels que l’âge et le bagage génétique. La figure 9 montre les résultats de cytométrie de flux représentatifs recueillis à partir d’un cytomètre de flux Becton Dickenson LSRII à 3 lasers à l’aide d’une diffusion vers l’avant de 450 et d’une diffusion latérale de 300, bien que nous vous recommandons d’optimiser les paramètres du cytomètre de flux spécifique que vous avez l’intention d’utiliser avant le prélèvement d’échantillons. Remarque : si un échantillon contient même des traces de contamination sanguine, le nombre total d’événements recueillis sera considérablement plus élevé que prévu et l’échantillon ne doit pas être pris en compte dans l’analyse.

6. Analyse quantitative par PCR (qPCR) des lavages nasaux

1. Dégeler les lysats de cellules à partir de l’étape 3.14 température ambiante.
2. Suivez le protocole recommandé fourni avec l’extraction d’ARN préférée de choix.
3. Après avoir terminé la procédure d’extraction de l’ARN comme indiqué, quantifier la quantité d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’une méthode basée sur l’électrophorèse(Figure 10). Nous obtenons régulièrement entre 975 et 3 250 ng d’ARN total par échantillon avec un rapport de 260/280 nm de >1,7 ou un nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) autour de 8,1±0,13.
4. Transcrivez l’ADNc à l’aide de la transcriptase inverse M-MULV selon le protocole du fabricant avec 1 000 ng d’ARN (maximum 13 μl).
5. Diluer les échantillons d’ADNc résultants 8x, et aliquote également dans 4 tubes séparés pour le stockage à long terme à -20 ou -80 °C.
6. Pour mesurer l’expression génique par qPCR, préparer des réactions d’échantillons de 25 μl en triple exemplaire sur de la glace ou un bloc froid contenant : 12,5 μl de mélange maître de 2x qPCR à partir de la trousse qPCR de votre choix, 0,25 μl de colorant de référence, 2 μl d’ADNc dilué (étape 7.5), 1 μl d’amorces mixtes avant et inverse (400 nM final), 9,25 μl d’eau sans RNAse-DNAse. Ce protocole est une adaptation des méthodes précédemment publiées^16.
7. En général, nous constatons qu’une amplification qPCR en deux étapes (95 °C pendant 10 min suivie d’un délai allant jusqu’à 40 cycles x [95 °C x 15 s, 60 °C x 1 min]) est efficace(figure 11a); toutefois, chaque paire d’amorces doit être optimisée. Des courbes de dissociation (fusion) doivent être effectuées après l’amplification pour s’assurer qu’aucune amplification non spécifique ne s’est produite. amplification (Figure 11b)
8. Nous exécutons régulièrement des courbes standard pour chaque gène analysé ainsi qu’un calibrateur standard (dérivé de l’homogénat des poumons ou de la rate) pour chaque plaque de 96 puits analysée. Les quantités de transcription relatives sont obtenues en normalisant d’abord les valeurs de seuil de cycle brut (Ct) par le colorant de référence et en transformant les valeurs résultantes à travers la courbe standard respective. Ces quantités relatives sont par la suite normalisées en fonction de l’étalonneur standard et d’un gène d’entretien ménager, le cas échéant.

Résultats

La figure 1 représente un schéma de vue d’ensemble résumant les principales étapes du protocole. Les figures 2-3 permettent de visualiser la méthodologie microbiologique inhérente aux protocoles décrits ici. La figure 4 représente le positionnement approprié d’une souris pour effectuer une colonisation intranasale, tandis que la figure 5 illustre généralement les changements de poids des souris colonisées avec la souche P1547 de S. pneumoniae. <...

Discussion

Dans cette étude, nous avons présenté des méthodes détaillées pour la colonisation intranasale de souris utilisant une souche d’isolat clinique de Streptococcus pneumoniae et l’isolement et la caractérisation ultérieurs des cellules immunitaires recrutées au nasopharynx en réponse aux bactéries. Nous avons démontré comment un inoculum bactérien peut être cultivé dans des milieux riches en nutriments et utilisé pour établir un événement de colonisation chez la souris, qui est initialement limité au nasopharynx. N...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris Ly6C FITC	BD Pharmingen	553104
Anti-souris Ly6G PE	BD Pharmingen
Anti-souris CD45.1 eFluor 450	eBioscience	48-0453-82
Antigène anti-souris F4/80 APC	eBioscience	17-4801-82
Anti-souris CD11c PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0114-82
Anti-souris CD11b PE-Cy7	eBioscience	25-0112-82
Anti-souris CD3 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0032-82
Anti-souris CD4 eFluor 605NC	eBioscience	93-0041-42
Tube en polyéthylène intramédical - PE20	Becton Dickinson	427406
BD 1 ml Seringue	Becton Dickinson	309659
BD 26 G 3/8 Biseau intradermique	Becton Dickinson	305110
Tampon RLT Tampon de lyse	Qiagen	79216
Difco Tryptique Soja Agar	Becton Dickinson	236950
Sang de mouton défibriné	PML Microbiologicals	A0404
RNAqueous-Micro Kit	Ambion	AM1931
M-MuLV Transcriptase	inverseNouvelle-Angleterre Biolabs	M0253L
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001