Method Article

Agroinfiltration efficace des plantes pour l'expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

DOI:

10.3791/50521

⸱

July 23rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

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Les plantes offrent un nouveau système pour la production de protéines pharmaceutiques à l'échelle commerciale qui est plus évolutive, rentable et sûre de paradigmes d'expression actuels. Dans cette étude, nous présentons une approche simple et pratique, mais évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium tumefaciens Dans les plantes pour l'expression transitoire de protéines.

Abstract

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Culture de cellules de mammifères est la plate-forme importante pour la production commerciale de vaccins humains et protéines thérapeutiques. Toutefois, il ne peut pas répondre à la demande mondiale croissante pour les produits pharmaceutiques en raison de son évolutivité limitée et coût élevé. Les plantes ont montré pour être l'une des plateformes les plus prometteuses alternatives de production pharmaceutiques qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Le développement récent de vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire rapide et à haut niveau de protéines recombinantes dans les plantes. Pour optimiser davantage l'utilité du système d'expression transitoire, nous démontrons une méthode simple, efficace et évolutive pour introduire du gène cible contenant Agrobacterium dans un tissu végétal dans cette étude. Nos résultats indiquent que agroinfiltration à la fois avec une seringue vide et méthodes ont abouti à la mise en place efficace d'Agrobacterium dans des feuilles et de la production robuste de deux protéines fluorescentes, GFP et DsRed. Par ailleurs,nous démontrons les avantages uniques offerts par les deux méthodes. infiltration de la seringue est simple et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il permet également la souplesse voulue pour infiltrer la durée du congé avec un gène cible, ou d'introduire des gènes cibles multiples sur une feuille. Ainsi, il peut être utilisé pour l'expression de l'échelle du laboratoire de protéines recombinantes ainsi que pour comparer différentes protéines ou des vecteurs de rendement ou d'expression cinétique. La simplicité de l'infiltration de la seringue suggère également son utilité dans l'enseignement secondaire et collégial pour le sujet de la biotechnologie. En revanche, l'infiltration sous vide est plus robuste et peut être adapté en place pour la production commerciale de protéines pharmaceutiques. Il offre également l'avantage d'être en mesure de agroinfiltrate espèces végétales qui ne se prêtent pas à l'infiltration de la seringue comme la laitue et Arabidopsis. Dans l'ensemble, la combinaison de la seringue et agroinfiltration à vide offre aux chercheurs et éducateurs un moyen simple, efficace et robusteméthodologie pour l'expression transitoire de protéines. Il va grandement faciliter le développement de protéines pharmaceutiques et de promouvoir l'enseignement des sciences.

Introduction

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Depuis les années 1970, les plantes ont été étudiées comme des alternatives aux cultures de cellules de mammifères, d'insectes et des bactéries pour la production commerciale de protéines recombinantes et des protéines thérapeutiques 1. Les systèmes à base de plantes pour l'expression de produits biopharmaceutiques ont montré des résultats prometteurs au cours des dernières années, plusieurs nouveaux traitements pour les maladies, comme la maladie de Gaucher 2, et la grippe aviaire H5N1 3, ont connu le succès dans les essais cliniques. Le développement des mécanismes compétents pour l'expression de protéines recombinantes ....

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Protocol

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1. Croissance des végétaux

  1. Lieu 60 pastilles de tourbe dans un bac de propagation. Ajouter 4 L d'eau du robinet et laisser les pastilles de tourbe absorber l'eau pendant 2 heures.
  2. Ajouter 2 N. benthamiana graines dans chaque tourbe granulés à l'aide d'un semoir, couvrent le plateau avec un dôme en plastique transparent, et leur permettre de germer dans une ° C, l'environnement d'humidité de 25 à 84% avec un cycle jour / nuit 16/8 h (figure 1A).
  3. Retirez le dôme deux semaines après le semis, drainer l'eau du bac, et ajouter 2 litres d'engrais de Jack à une concentration de 1,48 g /....

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Results

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1. L'expression de protéines fluorescentes par infiltration de la seringue

Pour démontrer l'efficacité de la seringue infiltration d'Agrobacterium dans les tissus de la plante, nous avons testé l'expression de deux protéines fluorescentes - GFP et DsRed - par deux plantes vecteurs viraux différents déconstruits - geminiviral et MagnICON - en N. benthamiana. Pour N. benthamiana feuilles qui ont été entièrement infiltrés avec agrobactéries vecteurs geminiviral .......

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Discussion

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La demande croissante de produits pharmaceutiques à base de protéines dans le monde entier exigent de nouvelles plates-formes de production qui sont robustes, évolutives et à faible coût et en toute sécurité. Les plantes ont montré pour être l'un des systèmes de production alternatifs les plus prometteurs pour la production de protéines pharmaceutiques. Au cours des dernières années, le développement de déconstruits vecteurs à base de virus a permis l'expression transitoire de protéines dans les plantes, ce qui .......

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Disclosures

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Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts financiers.

Acknowledgements

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Nous remercions R. Sun et d'autres étudiants du Laboratoire de Chen pour leur contribution à planter génération de matériel. Nous remercions également le Dr D. Green pour son soutien à la recherche de premier cycle au Collège de technologie et l'innovation (CTI). Cette recherche a été financée en partie par des subventions du NIH U01 AI075549 et 1R21AI101329 à Q. Chen, et une subvention SSE de CTI de l'Arizona State University à Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, et J. Stahnke sont des étudiants pris en charge par la subvention SSE.

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Materials

href="http://www.bio-rad.com/ » target="_blank">www.bio-rad.com

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Voir référence : Lico et Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Voir référence : Baird et Zacharias, et al 2000
MagnICONVector Icon Geneticsn/awww.icongenetics.com Voir référence : giritch et Marillonnet, et al 2006
GeminiviralVector Author' s Labn/aVoir la référence : Chen et He, et al 2011
N. benthamianaAuthor' s Labn/aherbalistics.com.au
>Agrobacterium tumefaciens souche gv3101Auteur' s Labn/aVoir référence : Lai et Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, plaquesSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, plaquesSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Sulfate de magnésium hepa hydratéSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TryptoneFisher73049-73-7www.fishersci.com
Extrait de levure BactoBecton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Bouillon nutritif DifcoBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrate BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillineSigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/ » target="_blank"> www.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Sodium HydroxideSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack' s EngraisHummert InternationalJul-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Pompe à videFisher13-878-113www.fishersci.com
Vacuum Air Régulateur ValveFisherNC9386590www.fishersci.com
Dessiccateur 12 1/8 » avec joint toriqueFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L TubRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Saver Bowl, 10 tasses will work
assiette/étagère 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
Plateau de propagation Domehydrofarm132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo Semoir à mainGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Cart 4 étagèreHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Tubes de Culture à Fond RondSigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/ » target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
SpectrophotomètreBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Spectrophotomètre CuvettesBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Microcentrifuge TubesUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
Centrifugeuse de paillasseBio-Rad166-0602EDU
Incubateur/AgitateurEppendorf ExcellaE25 www.eppendorf.com
Lumière ultraviolette Modèle# : UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
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References

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  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

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AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

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