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Article de méthode

Le

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DOI :

10.3791/50522

⸱

17 juillet 2013

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1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Dans cet article

Résumé

Le In ovo Chorioallantoic membrane (CAM) est greffé avec des tissus frais sarcome dérivées de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et des lignées cellulaires établies sarcome marquées par fluorescence permanents et transitoires. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement.

Résumé

Sarcome est une maladie très rare qui est de nature hétérogène, tout d'entraver le développement de nouvelles thérapies. patients atteints de sarcomes sont des candidats idéaux pour une médecine personnalisée après stratification, ce qui explique l'intérêt actuel pour l'élaboration d'un modèle de xénogreffe reproductible et à faible coût pour cette maladie. La membrane chorio poussin est un hôte immunodéprimé naturel capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En outre, il est facilement accessible, manipulée et imagées par stéréomicroscopie optique et fluorescence. L'histologie permet une analyse plus détaillée des interactions cellulaires hétérotypiques.

Ce protocole décrit en détail l'in ovo greffe de la membrane chorio avec sarcome dérivés de tissus frais de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et les lignes permanentes et transitoires marqués par fluorescence établies cellules sarcome (Saos-2 et SW1353). La survie rat de poussines sont en hausse de 75%. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement. Pour greffage localisé de suspensions cellulaires simples, gel ECM offre des avantages significatifs par rapport aux matériaux de confinement inertes. L'index de prolifération Ki67 est liée à la distance entre les cellules de la surface de la came et de la durée de l'application sur la came, celle-ci déterminant une période de temps pour l'addition de produits thérapeutiques.

Introduction

Sarcome est une tumeur rare du tissu conjonctif avec un taux de mortalité élevé dû à 1,2 résistance à la thérapie. Progrès dans la survie des patients est entravée par leur faible incidence annuelle, leur grande diversité, et le fait que les cellules de sarcome sont signalés à être difficile à la culture in vitro de 3,4.

L'utilisation de cellules en culture pour l'évaluation préclinique de thérapie a révélé que de nouvelles molécules, apparemment actif in vitro ne reflètent pas toujours les résultats dans le contexte clinique. En outre, les aberrations du génome révélées par des tableaux d'expression des gènes ne sont pas toujours en corrélation avec les caractéristiques de comportement de la tumeur chez le patient individuel 7.5. Pour tenter de résoudre ces problèmes, la médecine personnalisée a gagné en importance, ce qui se reflète dans l'augmentation de la recherche de modèles de xénogreffes 8-12.

Un essai in vivo a l'avantage de refléter l'interaction complexe entre ccellules ancer et de l'environnement de tissu de l'hôte dans les tumeurs solides, nécessaires à la prolifération du cancer et l'invasion 13. Actuellement, nous étudions l'utilisation de l'essai sur la membrane chorio-allantoïdien (CAM-test) comme un modèle de xénogreffe reproductible pour le sarcome 14,15. Ce test est largement utilisé pour l'étude de l'angiogenèse tumorale 16,17. Dans la littérature, cependant, nous avons trouvé des protocoles différents pour ce test, tandis que d'autres études ont observé une différence marquée de la croissance ou de l'angiogenèse selon différents protocoles 18,19.

Dans cet article, nous examinons l'effet des conditions de la CAM-dosage variable sur le comportement des cellules en utilisant des greffes tumorales, les suspensions de cellules uniques dérivées de tumeurs et de cultures cellulaires de sarcome établies.

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Protocole

Voir la Figure 1 pour un aperçu

Matériel tumoral

1. L'obtention et la préparation des échantillons tumoraux

Pour l'utilisation du matériel malade, l'approbation du comité d'éthique est nécessaire, et le consentement éclairé doit être obtenu à partir du patient.

  1. matériau de récolte de mandataire (minimum 1 cm 3) au moment de l'intervention, que ce soit une biopsie ou une résection d'un sarcome. Le site approprié de la biopsie est définie en utilisant dynamique de contraste IRM.
  2. Placer le matériau immédiatement dans un flacon stérile contenant du DMEM additionné de 1 000 U de pénicilline et 1 mg / ml de streptomycine.
  3. Transporter le flacon immédiatement (30 - 90 min) au laboratoire.

Toutes les procédures suivantes sont effectuées sous flux laminaire.

  1. Verser le contenu du flacon dans une boîte de Pétri stérile.
  2. Mettre l'échantillon tumoral dans de petites parties de maximum 1 mm 3 à l'aide d'un scalpel stérile. Retirez toutes les pièces calcifiées comme ils ont tendance à nuire à la transformation du tissu.
  3. Prendre au hasard 10 greffes tumorales pour l'application de la CAM.

2. Préparation des tumeurs dérivées des suspensions monocellulaires

Durée approximative: 3 heures

  1. Peser le tissu restant de l'échantillon.
  2. Mettre 2 - 4 g de tissu dans un tube à dissociateur, plus d'un tube peut être nécessaire de digérer tout le tissu de la tumeur restante.
  3. Pour la digestion de 2 - 4 g de tissu, ajouter la solution de 2,5 ml de collagénase 2 (500 U / ml de RPMI 1640) et une solution de DNase 2,5 ml (22 KU / ml RPMI 1640).
  4. Procédé du tissu selon le protocole de h_tumor de dissociateur. Il s'agit de 2 cycles d'incubation à 37 ° C en CO 2 incubateur tandis que le tube est secoué doucement pendant 30 min.
  5. Filtrer la suspension restante à travers un tamis cellulaire 150 um.
  6. Centrifuger le lysat à 1000 rpm pendant 5 kmn.
  7. Eliminer le surnageant.
  8. Reprendre le culot dans 10 ml de tampon de lyse érythrocytaire (ELB), permettant 10 minutes d'incubation avec suspension régulière.

Note: tampon de lyse érythrocytaire est fabriqué comme suit: Ajouter 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g de NH 4 Cl à 1000 ml aqua, utiliser NaOH 10 N pour ajuster le pH à 7,3, filtre sous pression à 0,22 um filtrer. Conserver à 4 ° C.

  1. Ajouter 25 ml de milieu de culture (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine) pour arrêter la réaction.
  2. Centrifuger la suspension à 1000 rpm pendant 5 min. La couleur de la pastille doit être blanc maintenant.
  3. Eliminer le surnageant.
  4. Ajouter 5 ml de milieu de la boulette. Filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire um 70.
  5. Compter le nombre de cellules vivantes / ml à l'aide d'un compteur automatique de cellules.

3. Cancer lignées cellulaires

SAOS2 cellules d'ostéosarcome (numéro ATCC: HTB-85) exprimant la protéine fluorescente verte ont été électroporation par le vecteur pEGFP-C1 en utilisant la lignée cellulaire Nucleofector Kit V selon le protocole du fabricant. Pour établir des lignées cellulaires stables, les cellules transfectées ont été sélectionnées dans G418 (1 mg / ml) pendant 4 semaines en ligne avec les précédents établis protocole 20. En outre le tri a été effectué par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) selon les instructions du fabricant.

Les cellules provenant de la lignée de cellules de chondrosarcome SW1353 (numéro ATCC: HTB-94) ou de suspensions de cellules individuelles de tumeur fraîchement préparés sont étiquetés à l'aide d'une membrane lipophile fluorescent tache rouge.

  1. Retirez les cellules du flacon de culture d'une manière classique en utilisant la trypsine (0,5% p / v) d'acide éthylène diamine (EDTA, 0,2% poids / volume) solution.
  2. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1000 rpm.
  3. Retirez le supernatant.
  4. Ajouter 1 ml de milieu sans sérum et 5 pi Dil (Vybrant Rouge) / 10 6 cellules.
  5. Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium et le mettre dans le CO 2 incubateur pendant 10 min à 37 ° C.
  6. Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 1000 rpm et éliminer le surnageant.

Essai sur la membrane chorioallantoïque

1. L'incubation des oeufs

  1. Les œufs fécondés provenant d'une écloserie commerciale locale garantissant 95% fécondation des œufs sont obligatoires.
  2. Les œufs fécondés peuvent être stockés à température ambiante jusqu'à 10 jours.

Remarque: avant de commencer l'incubation, la saleté, les plumes et les excréments sont soigneusement retirés des coquilles d'œufs mécaniquement par un essuyage à sec avec du papier absorbant, qui ont une grossière plutôt qu'une structure de surface molle. Essuyer les œufs avec 70% d'éthanol dénaturé ou tout autre réactif de nettoyage permet de réduire considérablement le taux de survie des embryons de poulet.

  1. Mettez les œufs dans le Incubteur d'un côté, le marquage de la surface supérieure. Le jour où les œufs sont placés dans l'incubateur est désignée 0 jours de développement embryonnaire.
  2. Réglez la température d'incubation à 37,8 ° C, et une humidité de 47%. Assurez-vous que l'option de rotation automatique est désactivée.

2. Ouverture des œufs

Durée: ± 60 min pour 25 oeufs

Le jour de développement 3, les œufs sont ouverts sous flux d'air laminaire. Ouverture des œufs lors d'une nouvelle résultats de la phase de développement des dommages à la CAM, comme la membrane a tendance à coller à la coque. Une lampe infrarouge est utilisé pour garder les œufs au chaud pendant la procédure. Pour améliorer la stérilité, nous recommandons l'utilisation de gants à la main.

  1. Placez l'oeuf dans le coquetier, avec le côté marqué vers le haut.
  2. Abaisser le niveau de la CAM en enlevant deux ml d'albumine à travers une aiguille de calibre 18 insérées à la pointe de l'œuf. Si l'aiguille est émoussée après perforation plusieurscoquilles d'œufs, remplacer l'aiguille. Si non, trop de force doit être exercée, ce qui entraîne des dommages au jaune d'œuf ou d'une fracture de la coquille. Parfois l'aiguille est bloqué par le chalazes, l'un des 2 bandes spirales suspension le jaune dans l'albumen. Ceci peut être résolu en poussant doucement le piston vers le bas jusqu'à ce que le bloc est résolu. Si le jaune d'oeuf est aspiré dans la seringue, remplacer l'aiguille ainsi que la seringue. Parfois, l'embryon meurt après cet événement. Si une quantité insuffisante d'albumine est enlevé, la CAM sera endommagé lors de la coquille est enlevée.
  3. Appliquer un film adhésif semi-perméable sur le côté supérieur de la coquille marquée afin d'empêcher déversement de particules de coquille sur la CAM en coupant la fenêtre.
  4. Faire un trou de mise en place d'un petit poinçon à la surface de l'oeuf.
  5. Couper une fenêtre de 1 cm 2 dans la coquille, à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux pointus stériles.
  6. Cœur battant de l'embryon et les vaisseaux adjacents peuvent être observés à thsurface de e du jaune d'oeuf. Retirez les œufs non fécondés ou d'embryons morts. Un aspect interrompu des vaisseaux sanguins caractérise embryons morts.
  7. Joint d'étanchéité de la fenêtre avec un film adhésif semi-perméable. Il n'est pas nécessaire de couvrir le site de ponction, à moins que la coquille a craqué lors de l'insertion de l'aiguille.

3. Procédure de vaccination

Durée: ± 1 h par lignée cellulaire

Le poussin embryonnaire jour 9 développement, les œufs sont inoculés sous flux d'air laminaire.

Evaluation de cellule cancéreuse la diffusion à travers la CAM nécessite confinement des cellules à une surface limitée lors de l'inoculation. Matrigel est une matrice (ECM) gel extracellulaire du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm fréquemment utilisé dans des conditions de culture de cellules expérimentales. Il s'agit d'un liquide lorsqu'il est refroidi, mais subira une polymérisation thermiquement activé lorsqu'il est mis à 20 - 40 ° C, formant ainsi un gel stable. Au cours deles expériences, Matrigel sont conservées dans une boîte contenant de la glace fondante.

Note: Nous insistons sur le fait de ne pas utiliser des lamelles perforées. Nous avons observé fixation et la croissance des cellules cancéreuses greffées sur le disque en plastique de sollicitation ainsi un potentiel de croissance des cellules sur la membrane elle-même.

  1. Remettre en suspension un culot cellulaire dans ECM gel refroidi à une concentration de 10 6 cellules/100 pi gel ECM. Conserver cette solution sur la fonte des glaces.
  2. Douanes partie de la membrane semi-perméable avec une paire de chirurgicale stérile sous flux d'air laminaire. Si le film adhésif est complètement supprimé, cela se traduira par une plus grande proportion de la mortalité embryonnaire due à la contamination.
  3. Touchez le droit CAM-dessous de la fenêtre de shell légèrement avec une tige de verre stérile, afin d'enlever la couche de cellules épithéliales. Toucher la CAM avec une tige de verre stérile s'avère être moins traumatisant que d'utiliser un scalpel n ° 11, qui exige plus de maniabilité et d'expérience. Petites hémorragies peuvent se produire.
  4. Adding matériel tumoral.
  5. Pour les greffes tumorales: abaissez doucement un morceau de tissu sur la CAM avec une paire de pinces stériles, sans presser.
  6. Pour la procédure de gel ECM: Ajouter 4x 25 pi de la suspension de gel cellule-ECM à la CAM, les uns sur les autres, ce qui permet le gel ECM à polymériser entre les applications. De cette manière, une plaque adhérente contenant les cellules cancéreuses est créé.
  7. Joint d'étanchéité de la fenêtre d'enveloppe à nouveau avec un film adhésif semi-perméable.

4. Imagerie et la récolte de la CAM

Durée: 2 h pour 25 oeufs

Le poussin embryonnaire jour le développement 16, les cames sont récoltés. Travaillant sous flux laminaire n'est pas nécessaire.

  1. Agrandir la fenêtre avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Veillez à ne pas couper trop bas, sinon la CAM sera endommagé, entraînant une hémorragie des vaisseaux lésés.
  2. Ajouter 300 - 500 pi de PBS D avec une pipette sur la secte CAMionique contenant le matériau inoculée. Si aucune des sondes fluorescentes sont utilisées, le formaldéhyde tamponné peut être utilisé car cela rend la membrane rigide, ce qui facilite la coupe de la membrane.
  3. Faire une photographie de la came dans l'oeuf à travers un microscope à fluorescence stéréo, équipé d'une caméra numérique en couleurs, en utilisant à la fois la GFP ou le filtre DSR, et aucun filtre. Pour les greffes tumorales, toutes les photographies sont prises sans filtres. Éclairage par le dessus par LED est fortement recommandé lors de photographier (Figure 2).
  4. Fiche migration des cellules de tumeur des cellules marquées. Les frontières des tumeurs peuvent être irrégulières et effilochées. Cellules épars peuvent être présents près des frontières tumorales. Dans certains échantillons, des rangées de cellules tumorales peuvent être observées (Figure 3).
  5. Découper la membrane avec une paire de ciseaux stériles à la frontière se trouvant contre la coque.
  6. Placez le CAM récolté dans une boîte de Pétri stérile rempli de PBS D ou tamponné pourformaldéhyde.
  7. Faire une photographie à la fois du côté supérieur et le côté inférieur de la came, à la fois avec et sans filtre.
  8. Placez la membrane dans un contenant étiqueté avec du formaldéhyde tamponné pendant au moins 72 heures.
  9. Intégrer les CAM dans de la paraffine et de les préparer pour l'examen histologique. Prendre soin de couper les greffes de tumeurs au centre du nodule, en s'assurant que la surface de coupe est parallèle au fond de la cassette. Sinon, l'interaction entre le CAM et la greffe tumorale ne sera pas visible. La même stratégie s'applique à des plaques de gel ECM: la surface tournée vers la lame de coupe doit être perpendiculaire à la plaque.

5. L'évaluation histologique

Hématoxyline-éosine et Ki-67 immunohistochimie ont été effectuées pour obtenir des précisions, si nécessaire. L'immunohistochimie a été réalisée sur des coupes de tissus inclus dans la paraffine fixés au formol de 3,5 pm d'épaisseur, en utilisant une coloration de lames selon automatiséaux instructions du fabricant. Un anticorps monoclonal de souris primaire de Ki-67 (clone MIB-1, dilution 1/100) a été utilisé. Induite par la chaleur épitope a été réalisée en utilisant la cellule conditionné 1, et la visualisation a été réalisé avec le kit de détection DAB Universal, selon les instructions du fabricant. Déshydratation des sections de tissus a été réalisée à l'aide d'une colleuse automatique.

Pour la SAOS2 et les lignées de cellules SW1353, le nombre de cellules Ki67-positives et Ki67 négatif nuclei/100 um 2 ont été comptés en trois zones: l'une près de la frontière de la CAM, un près de la surface et un dans le centre de la plaque de gel ECM. Cette procédure a été répétée 6x pour chaque diapositive Ki-67 taché. L'indice de prolifération a été déterminée pour chaque diapositive en divisant le nombre de cellules Ki67-positives par le nombre total de cellules comptées.

La nécrose se définit par une perte de dispersion fine de la chromatine dans le noyau de la cellule, accompagné par fading des marges de cellules distinctes. Pour xénogreffes, la nécrose est marqué comme complet, partiel (souvent à la surface), ou absents. L'infiltration de cellules tumorales dans la came est défini par l'observation de cellules tumorales dans le mésoderme de la CAM, et est marqué comme étant présent ou absent.

Trois points sont marqués pour le comportement de l'hôte. l'infiltration des fibroblastes est défini comme cellules allongées sortant du CAM et d'envahir la greffe / plaque tumeur, et est marqué comme étant présent ou absent. Interposition vasculaire peut être observé comme interposition de la prolifération des vaisseaux chiches, caractérisés par la présence d'érythrocytes de poulet nucléées.

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Résultats

Évaluation de la CAM

Greffes tumorales deviennent adhérentes à la CAM (figure 2A). Suspensions de cellules isolées à partir de matériaux patients présentent souvent une séché, plaque légèrement surélevée (figure 2D). Après exérèse de la CAM, marquée plissement de la membrane se produit (figures 2E et 2F).

Pour les lignées cellulaires commerciaux la plaque devient plus opaque dans le temps, indiquant...

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Discussion

Moment de l'inoculation et la récolte

Chronométrant le jour de l'inoculation a été effectuée à l'aide SAOS2 en gel ECM (36 CAM) et variait entre embryonnaire journée de perfectionnement 5 et 10.

Avant le jour d'incubation 9, le CAM a pas toujours assez grand pour soutenir le gel ECM, nous avons appliqué. A la récolte, les cellules tumorales devaient parfois être récupérés à partir de la CAM profond, et quelques échantillons de gel ECM gisaient en vra...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les cellules de la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 ont été aimablement fournies par le professeur PCW Hogendoorn et Dr. J. Bovée de l'Université de Leiden, Pays-Bas. Nous remercions J. Mestach et G. Wagemans pour une excellente assistance technique et G. De Bruyne pour le dessin professionnel de la vue d'ensemble de notre protocole.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cell Line Nucleofector Kit VAmaxaVCA-1003
solution de collagénase 2 (500 U/ml RPMI 1640)Sigma AldrichC6885
DMEMInvitrogen41965-039
DMSOSigmaD8418
Dnase solutionSigma AldrichDN25
G418Invitrogen11811031
MatrigelSigma-AldrichE1270
anticorps monoclonal primaire de souris Ki67Dako DanemarkMIB-1
ParaformaldéhydeFlukaD76240
PBSInvitrogen20012019
PBSDInvitrogen14040083
peGFP-C1 vecteurClontech632470
Pénicilline/streptomycineInvitrogen15140163
RPMIInvitrogen22409-015
Solution trypsine-EDTAInvitrogen25300054
Vybrant marquage cellulaire DiILifetechnologies22885
Compteur de cellules automatisé CountessInvitrogenC10227
appareil photo couleur numériqueLeicaDFC 340 FX
Incubateur d’œufsnumérique Auto Elex CoR-COM 50
FACSBD BiosciencesFACSAriaIII
Gentlemacs C-TubeMiltenyi Biotech130-093-237
Dissociateur GentlemacsMiltenyi Biotech130-093-235
Manuel d’utilisation du dissociateur Gentlemacs contenant h_tumor protocoleMiltenyi Biotech
[en-tête]
film adhésif semi-perméable (Suprasorb F)Lohmann& Rauscher20468
microscope stéréo à fluorescenceLeicaM205 FA Tissue-Tek
Film automated CoverslipperSakura6400
ultraView Universal DAB Detection KitVentana Medical Systems Inc760-500
Ventana Automated Slide StainerVentana Medical SystemsBenchmark XT

Références

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