Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Résumé

Le In ovo Chorioallantoic membrane (CAM) est greffé avec des tissus frais sarcome dérivées de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et des lignées cellulaires établies sarcome marquées par fluorescence permanents et transitoires. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement.

Résumé

Sarcome est une maladie très rare qui est de nature hétérogène, tout d'entraver le développement de nouvelles thérapies. patients atteints de sarcomes sont des candidats idéaux pour une médecine personnalisée après stratification, ce qui explique l'intérêt actuel pour l'élaboration d'un modèle de xénogreffe reproductible et à faible coût pour cette maladie. La membrane chorio poussin est un hôte immunodéprimé naturel capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En outre, il est facilement accessible, manipulée et imagées par stéréomicroscopie optique et fluorescence. L'histologie permet une analyse plus détaillée des interactions cellulaires hétérotypiques.

Ce protocole décrit en détail l'in ovo greffe de la membrane chorio avec sarcome dérivés de tissus frais de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et les lignes permanentes et transitoires marqués par fluorescence établies cellules sarcome (Saos-2 et SW1353). La survie rat de poussines sont en hausse de 75%. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement. Pour greffage localisé de suspensions cellulaires simples, gel ECM offre des avantages significatifs par rapport aux matériaux de confinement inertes. L'index de prolifération Ki67 est liée à la distance entre les cellules de la surface de la came et de la durée de l'application sur la came, celle-ci déterminant une période de temps pour l'addition de produits thérapeutiques.

Introduction

Sarcome est une tumeur rare du tissu conjonctif avec un taux de mortalité élevé dû à ^1,2 résistance à la thérapie. Progrès dans la survie des patients est entravée par leur faible incidence annuelle, leur grande diversité, et le fait que les cellules de sarcome sont signalés à être difficile à la culture in vitro ^{de 3,4.}

L'utilisation de cellules en culture pour l'évaluation préclinique de thérapie a révélé que de nouvelles molécules, apparemment actif in vitro ne reflètent pas toujours les résultats dans le contexte clinique. En outre, les aberrations du génome révélées par des tableaux d&#....

Protocole

Voir la Figure 1 pour un aperçu

Matériel tumoral

1. L'obtention et la préparation des échantillons tumoraux

Pour l'utilisation du matériel malade, l'approbation du comité d'éthique est nécessaire, et le consentement éclairé doit être obtenu à partir du patient.

1. matériau de récolte de mandataire (minimum 1 cm ³⁾ au moment de l'intervention, que ce soit une biopsie ou une résection d'un sarcome. Le site approprié de la biopsie est définie en utilisant dynamique de contraste IRM.
2. Placer le matériau immédiatement dan....

Résultats

Évaluation de la CAM

Greffes tumorales deviennent adhérentes à la CAM (figure 2A). Suspensions de cellules isolées à partir de matériaux patients présentent souvent une séché, plaque légèrement surélevée (figure 2D). Après exérèse de la CAM, marquée plissement de la membrane se produit (figures 2E et 2F).

Pour les lignées cellulaires commerciaux la plaque devient plus opaque dans le temps, indiquant.......

Discussion

Moment de l'inoculation et la récolte

Chronométrant le jour de l'inoculation a été effectuée à l'aide SAOS2 en gel ECM (36 CAM) et variait entre embryonnaire journée de perfectionnement 5 et 10.

Avant le jour d'incubation 9, le CAM a pas toujours assez grand pour soutenir le gel ECM, nous avons appliqué. A la récolte, les cellules tumorales devaient parfois être récupérés à partir de la CAM profond, et quelques échantillons de gel ECM gisaient en vra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
solution de collagénase 2 (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
anticorps monoclonal primaire de souris Ki67	Dako Danemark	MIB-1
Paraformaldéhyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vecteur	Clontech	632470
Pénicilline/streptomycine	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Solution trypsine-EDTA	Invitrogen	25300054
Vybrant marquage cellulaire DiI	Lifetechnologies	22885
Compteur de cellules automatisé Countess	Invitrogen	C10227
appareil photo couleur numérique	Leica	DFC 340 FX
Incubateur d’œufs	numérique Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Dissociateur Gentlemacs	Miltenyi Biotech	130-093-235
Manuel d’utilisation du dissociateur Gentlemacs contenant h_tumor protocole	Miltenyi Biotech
[en-tête]
film adhésif semi-perméable (Suprasorb F)	Lohmann& Rauscher	20468
microscope stéréo à fluorescence	Leica	M205 FA Tissue-Tek
Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT