Marquage métabolique de leucine Rich Repeat Kinase 1 et 2 avec radioactifs Phosphate

Résumé

Répétition riche en leucine kinases 1 et 2 (et LRRK1 LRRK2) sont des protéines à domaines multiples qui codent à la fois GTPase et domaines de kinase et qui sont phosphorylées dans les cellules. Ici, nous présentons un protocole d'étiqueter LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec ³² P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer leur niveau global de phosphorylation cellulaire.

Résumé

Leucine répétition riche kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont des paralogues qui partagent une organisation de domaine similaire, comprenant un domaine de sérine-thréonine kinase, un Ras de protéines complexe domaine (ROC), une extrémité C-terminale de ROC domaine (COR), et riche en leucine et répétitions ankyrine-comme à l'extrémité N-terminale. Les rôles cellulaires précises de LRRK1 LRRK2 et n'ont pas encore été élucidé, mais LRRK1 a été impliquée dans la tyrosine kinase du récepteur de signalisation ^1,2, tandis que la LRRK2 est impliquée dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson ^3,4. Dans ce rapport, nous présentons un protocole d'étiqueter les protéines LRRK1 et LRRK2 dans les cellules avec ³² P orthophosphate, fournissant ainsi un moyen de mesurer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de ces deux protéines dans les cellules. En résumé, l'affinité des protéines marquées LRRK sont exprimés dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant ³² P-orthophosphate. Le ³² P-orthophosphate est assimilé par les cellules après seulement quelquesheures d'incubation et l'ensemble des molécules dans la cellule contenant des phosphates sont ainsi marqués radioactivement. Via l'étiquette d'affinité (3xflag) les protéines de LRRK sont isolés à partir d'autres composants cellulaires par immunoprécipitation. Les immunoprécipités sont ensuite séparés par SDS-PAGE, transféré sur des membranes et de l'analyse des phosphates incorporés PVDF est effectuée par autoradiographie ⁽³² de signal P) et la détection de l'Ouest (signal de protéines) des protéines sur les blots. Le protocole peut être facilement adapté pour surveiller la phosphorylation de toute autre protéine qui peut être exprimée dans des cellules et isolé par immunoprécipitation.

Introduction

Leucine riche répétition kinases 1 et 2 (LRRK1 et LRRK2) sont paralogues multidomaines qui partagent une organisation de domaine similaire. Les deux protéines codent pour une séquence de GTPase apparenté à la famille Ras (Ras GTPases de complexes de protéines, ou ROC) ainsi que d'un C-terminal du domaine ROC (COR), classer efficacement les deux protéines de la famille des protéines ROCO ^5,6. N-terminale du domaine tandem ROC-COR, les deux protéines codant pour le domaine répétitions riches en leucine ainsi que d'un domaine ankyrine-like, alors que seulement LRRK2 code pour un tatou supplémentaire domein ^6-8. C-terminale de ROC-COR, les d....

Protocole

Le présent protocole utilise radioactif marqué au ^32P orthophosphate de suivre la phosphorylation cellulaire de LRRK2. Il est important de garder à l'esprit que toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l'aide des mesures de protection appropriées pour réduire l'exposition de rayonnement radioactif de l'opérateur et de l'environnement. Composés contenant des isotopes émettant des rayonnements ionisants peuvent être nocifs pour la santé humaine et l'octroi de licences et la réglementation stricte à un contrôle institutionnel et au niveau national leur utilisation. Les expériences de ce protocole on....

Résultats

Afin de comparer les niveaux de phosphorylation de l'ensemble de LRRK1 et LRRK2 dans les cellules, 3xflag marqué LRRK1 et LRRK2 ont été exprimés dans les cellules HEK293T ^15. Les cellules ont été cultivées dans des plaques à 6 puits et marquées au ³² P et analysés comme décrit ci-dessus dans le texte de protocole. Figure 1 montre les résultats représentatifs pour le marquage métabolique des LRRK1 et LRRK2 dans des cellules HEK293T. Radioactifs phosphate incorporation est .......

Discussion

Ce document fournit un protocole de base pour tester le niveau de phosphorylation général de LRRK1 et LRRK2 dans des lignées cellulaires en utilisant un marquage métabolique avec ³² P-orthophosphate. La stratégie globale est simple. Affinity LRRK protéines marquées sont exprimées dans des cellules HEK293T qui sont exposées à un milieu contenant ³² P-orthophosphate. Le ³² P-orthophosphate est assimilé par les cellules après quelques heures d'incubation et l'ensemble des molécules .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Radionucléide de phosphore 32, 1 mCi, tampon de phosphate disodique dans 1 ml d’eau	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’ ; s Medium Eagle modifié (D-MEM) (1X), liquide (high glucose)	Invitrogen	11971-025	Ce milieu ne contient pas de phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	Pour un produit équivalent avec du gel de couleur rouge (utile pour visualiser plus facilement les billes), utilisez cat. N° F2426.
Filtre buvard extra épais	Bio-Rad	1703965
Ponceau S solution	Sigma	P7170