Méthodes pour effectuer des croix dans Setaria viridis, Un nouveau système modèle pour les graminées

Résumé

Nous avons développé une méthodologie pour effectuer des croisements dans viridis Setaria viridis (S.). Le procédé consiste à tailler la panicule préalable à un traitement à l'eau chaude pour tuer pollen viable. Croix sont effectuées suivant un régime de croissance bien maîtrisée et aboutissent généralement à la reprise de 1 à 7 pollinisation croisée semences / s par panicule.

Résumé

Setaria viridis est un système modèle émergent de graminées C _4. Elle est étroitement liée à l'alimentation de la bioénergie actions panic raide et la récolte de céréales millet. Récemment, le génome de 510 Mb de millet, S. italica, a été séquencé ^1,2 et une séquence du génome 25x de couverture du rapport S. mauvaises herbes viridis est en cours. S. viridis a un certain nombre de caractéristiques qui le rendent potentiellement excellent système génétique modèle, y compris un temps de génération rapide, petite taille, les besoins de croissance simples, la production de semences prolifique ³ et systèmes développés pour la transformation à la fois transitoire et stable ^4. Cependant, la génétique de S. viridis est largement inexploré, en partie, en raison de l'absence de méthodes détaillées pour effectuer les croisements. À ce jour, aucun protocole standard a été adopté qui permettra la production rapide de graines de croisements contrôlés.

La pression de protocoleENTED ici est optimisée pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis, adhésion A10.1. Nous avons utilisé un simple traitement thermique avec de l'eau chaude pour la castration après la taille de la panicule de conserver 20-30 fleurons et l'étiquetage des fleurs pour éliminer les graines résultant de fleurs nouvellement développés après la castration. Après avoir testé une série de traitements thermiques à des températures permissives et en faisant varier la durée d'immersion, nous avons établi une température optimale et la plage de temps de 48 ° C pendant 3-6 min. En utilisant cette méthode, un minimum de 15 croix peut être réalisée par un seul ouvrier et par jour et une moyenne de 3 à 5 progéniture retrempe par panicule peut être récupéré. Par conséquent, une moyenne de 45 à 75 retrempe descendance peut être produite par une personne en un seul jour. Une large application de cette technique sera de faciliter le développement des populations de lignées recombinantes de S. viridis X S. viridis ou S. viridis X S. italica, la cartographie des mutations par nombre seanalyse gregant et créer des mutants d'ordre supérieur pour l'analyse génétique.

Introduction

S. viridis est un NADP-ME-type C ₄ herbe étroitement liée à l'alimentation de la bioénergie actions panic raide (NAD-ME sous-type), la récolte de céréales millet, et la mauvaise herbe agricole herbe de Guinée ^5. Le génome de 510 Mb de forme cultivée de Setaria, S. italica, a récemment été séquencé ^1,2 et une séquence du génome 25x de couverture de la mauvaise herbe apparentée, S. viridis, est en cours (non publié). S. viridis a un certain nombre de caractéristiques qui le rendent potentiellement excellent système génétique modèle, y compris un temps de génération rapide, petite taille, les besoins de croissance simples, et la production de semences prolifique ^3. Surtout, des méthodes ont été développées récemment pour les transformation transitoire et stable de S. viridis qui offrent la possibilité de créer des plantes transgéniques ^4. Cependant, un obstacle majeur dans le développement d'outils génétiques pour S. viridis est son recalciTrance à pollinisation croisée. À ce jour, aucun protocole standard a été publiée qui permettra la production rapide de graines de croisements contrôlés.

Croisements génétiques dans S. italica sont généralement effectuées par émasculation par la suppression des anthères des fleurs ^6,7,8 ou par traitement thermique de fleurs de parents femelles ^9-11. Suite à ces traitements, anthères ou panicules de fleurs non traitées / parents mâles sont légèrement poncées contre les stigmates de libération du pollen. En émasculation, anthères sont enlevés à l'aide de pinces fines immédiatement après le fleuron s'ouvre et l'anthère commence à exsert, mais n'a pas encore émis du pollen ^6-8. Parmi les défis de cette dernière méthode est la difficulté dans l'exercice de la castration dans un intervalle de temps étroite entre l'ouverture et la libération du pollen de la fleur. La durée d'ouverture et la fermeture d'une seule fleur peut varier en fonction de l'adhésion et l'état de l'environnement, et peut varier de 7 min ^{6 à 2,5 h 12 à S. italica. Depuis effusion de pollen se produit comme anthères exsert du fleuron, anthères doivent être enlevés soigneusement et rapidement, et donc, il est difficile d'éviter la contamination due à l'auto-pollinisation. En outre, comme la pollinisation sont effectuées immédiatement après la castration, le nombre de croix qui peuvent être exécutées par personne / jour est limitée.}

Comme méthode alternative, panicules matures peuvent être trempées dans l'eau chaude pour chauffer-tuer le développement des grains de pollen ^9,10,13,14 avec l'avantage d'effectuer des croix sur un grand nombre de panicules. Cependant, la température et la durée du traitement thermique varie largement d'expériences différentes (par exemple 47 ° C pendant 10 min et ¹⁴ 42 ° C pendant 20 min ^10). En outre, aucune des analyses systématiques sur l'efficacité de emasculations de chaleur médiation ont été publiées. Ainsi, une norme et méthode simple pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis serait grandement accélérer le développement des ressources génétiques et l'établissement de S. viridis comme un système de modèle au sein de la communauté de la recherche.

Nous rapportons le développement et l'optimisation d'un protocole standard pour effectuer des croisements génétiques dans S. viridis. Les plantes sont cultivées dans des environnements contrôlés à synchroniser le développement des fleurs et d'augmenter la reproductibilité de la procédure. Croix sont effectuées en utilisant un S. transgénique ligne viridis parent mâle contenant le gène rapporteur GUS ⁴ à faciliter l'identification des croisements génétiques contrôlés avec succès. Le transgène GUS est entraînée par un promoteur de l'ubiquitine du riz qui permet au ballon de graines F1 immédiatement après la récolte et fournit ainsi un dosage qualitatif facile de déterminer l'efficacité de la castration et la pollinisation. Nous avons utilisé un simple traitement thermique avec de l'eau chaude pour l'émasculation accompagnée par l'étiquetage des fleurs qui ont été emasculated pour éliminer les graines résultant de fleurs nouvellement développés après la castration. Après avoir testé une série de traitements thermiques à des températures permissives et varier la durée de trempage dans l'eau chaude, nous avons établi une température et de temps optimales durées de 48 ° C 3-6 min. Un traitement par le froid avant l'aube a été trouvé pour promouvoir la floraison synchrone dans les deux parents afin de faciliter la pollinisation croisée. Nous avons également discuté des étapes clés dans le protocole et l'application future de cette méthode à d'autres adhésions Setaria.

Protocole

Une. Croissance de S. viridis

1. Définissez les conditions de la chambre de croissance à 31 ° C/22 ° C (jour / nuit), 12 h lumière/12 h sombre, l'humidité relative de 50% avec un traitement avant l'aube du 15 ° C 8 heures et demie-09h00 AM. (Figure 1). Dans ces conditions, S. viridis A10.1 prend environ 21-22 jours à partir de semis à la floraison.
2. Remplissez appartements (4 x 9 cellules) avec Metro Mix 360 et enlever une cellule pour l'arrosage.
3. Eau légère brume sur la surface du sol.
4. Semer des graines à la surface du sol, une graine par cellule.
5. Recouvrez les graines d'une couche de sol (environ 0,5 cm)
6. Mist la surface de sol et d'eau appartements à partir du bas. Gardez l'arrosage du fond après semis.
7. Pour chaque croix qui sera effectuée au moins trois usines sera utilisé comme parents femelles et neuf usines sera utilisé en tant que parents de sexe masculin. Semences semis doit être échelonnée comme toutes les plantes ne fleurissent le même jour. Graine sowing est recommandé chaque jour sur une période de trois jours.
8. Arroser les plantes en 1-2 fois par jour, ce qui dépend de la taille des plantes et de l'état du sol. L'excès d'eau dans le sol n'est pas favorable à la croissance optimale des plantes, et peut conduire à la croissance des champignons dans le sol et les dommages des tissus foliaires.
9. Fertiliser les plantes deux fois par semaine, à l'aide de Jack 15-16-17 à une concentration de 100 ppm.

2. Découper et d'étiquetage des panicules Avant émasculation - Jour 1

1. Dans l'après-midi ou le soir avant la pollinisation, déplacer des plantes de la chambre de croissance au laboratoire (température (T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, l'humidité relative (HR) 21,79% ± 1,15%).
2. Sélectionnez les panicules primaires ayant une fleur à 1/3 de fleurs sur la panicule qui ont déjà fleuri.
3. Dans cette étude, les quatre domaines au sein de la panicule sont définis comme suit (Figure 2A; pointe, milieu distale, moyenne et base proximale).
4. Idéalement, choiea panicule avec 1-5 fleurs qui ont fleuri, couper le sommet de la panicule (extrémité distale), et supprimer toutes les fleurs dans les sections intermédiaire et base de proximité à l'aide de ciseaux à ressort ou une pince fine.
5. Si une panicule a environ dixième-cinquième de fleurs qui ont fleuri, coupez le bout et couper des fleurs de la base de la panicule, ne conserver que la partie inférieure du milieu distale et la partie supérieure du milieu proximal pour tailler davantage.
6. Si une panicule a environ un quart-1/2 de fleurs qui ont fleuri, coupez la partie centrale distale et ne conserver que la section du milieu proximal pour plus de garniture.
7. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper légèrement les poils.
8. Retirez toutes les fleurs qui ont fleuri et toutes les fleurs immatures laissant environ 20-30 fleurs / panicule qui sont distribués uniformément dans la région (figure 3). Pratique des soins de conserver les poils de la région qui seront pollinisées afin de protéger les fleurons de possibles dommages de la chaleur.Pour chaque épillet, conserver le fleuron le plus mature supérieure. La plupart fleuron supérieurs auront une probabilité plus élevée de la floraison au moment de la pollinisation (figure 2B).
9. Marquer un côté de chaque fleur avec un marqueur permanent rouge et enregistrer le nombre de fleurons de la panicule (figure 2B).
10. Drapeau de la panicule avec les informations suivantes: la date de l'émasculation, la durée et la température à laquelle la castration est effectuée.
11. Une fois la panicule est coupé, retirez tous les talles de chaque plante pour assurer la redistribution de plus de ressources pour le développement de la panicule principale.

3. Émasculation avec Eau Chaude-trempage - Jour 1

1. Régler le bain d'eau à 48 ° C ± 0,1 ° C pendant le traitement thermique.
2. Pliez doucement les panicules garnis et les tremper dans l'eau chaude à 48 ° C pendant 3-6 min. Faites attention à ne pas casser la tige de la panicule.
3. Environ 3-4 panicules peuvent être trempés together à une heure, tout en maintenant un espace suffisant entre les panicules à une distribution uniforme de la chaleur. Il est essentiel de submerger toute la panicule dans l'eau chaude pendant le traitement thermique. La dernière feuille (la feuille sous-tendant la panicule qui fournit les éléments nutritifs à la panicule) ne doit pas entrer en contact avec de l'eau chaude pour éviter les dommages de la chaleur dans les tissus de la feuille.
4. Une fois la castration est effectuée pour la durée souhaitée, retirez panicules du bain d'eau et secouez doucement hors de l'eau à partir de la panicule.
5. Placez un sac de pain micro-perforé sur mesure pour couvrir entièrement la panicule émasculé et le fixer avec une ligature. Sacs à pain Micro-perforées peuvent être personnalisés en fonction de la taille de la panicule (notamment dans la vidéo).
6. Placez les plantes de retour dans la chambre de croissance jusqu'au lendemain.

4. Crossing / pollinisation après émasculation - Jour 2 et Jour 3

1. A 09h00 le jour 2 et jour 3, déplacer femelle (émasculé) et male parents de la chambre de croissance au laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) à réaliser des croisements.
2. Observer et ajouter un autre point rouge à fleurs qui ont fleuri ou sont en fleurs à l'aide d'un marqueur permanent rouge. Inscrivez le nombre total de fleurs épanouies par panicule.
3. Notez la date de la pollinisation et le nom du parent mâle sur le tag pour garder une trace de ce que les croisements sont effectués.
4. Respecter le temps de pic de la floraison chez les parents de sexe masculin. Dans nos conditions de chambre (figure 1) des fleurs sur les panicules du parent mâle commencent ouverture synchrone autour de 10:10. À partir du moment de l'ouverture des fleurs, le exsertion complète des anthères et la libération du pollen se fera après 20 min.
5. L'étape idéale pour la pollinisation est l'étape au cours de laquelle le pollen du parent mâle est libéré. Les fleurs se ferment après 20 min de la libération du pollen. Par conséquent, la durée de la floraison est d'environ 40 min à partir du moment de l'ouverture de l'écoulementteurs. La couleur du pollen passe du blanc jaunâtre au brun sur une période d'environ 30 minutes après que la fleur se referme.
6. Commencez dès que la pollinisation anthères blanc jaunâtre sont visibles sur les fleurs de parent mâle. Pollinisations sont effectuées sur les jours 2 et 3 en utilisant l'une des trois techniques:
   1. Panicule à panicule pollinisation: en utilisant un panicule détaché que le mâle, frottez doucement la panicule avec la panicule émasculé pour faciliter la pollinisation et jetez la panicule mâle pour éviter la contamination. Répétez le processus de pollinisation jusqu'à ce que chaque panicule émasculé a été pollinisées par 2-3 panicules.
   2. Anthères à la stigmatisation pollinisation: en utilisant une pince ramasser une fleur qui s'épanouit avec anthères blanc jaunâtre ou choisir anthères et physiquement en contact avec le stigmate de la fleur sur le parent femelle. Utilisez une fleur du parent mâle pour polliniser une fleur sur la panicule émasculé. Répétez la pollinisation process jusqu'à ce que chaque stigmate sur la panicule émasculé a été pollinisées par les quelques (2-3) fleurs / anthères. Le port d'une visière grossissant rendra une meilleure visibilité pour effectuer la pollinisation.
   3. Entre les pollinisations de différents parents mâles, plonger la pince à 95% d'éthanol puis en les essuyant avec Kimwipes pour éviter la contamination en raison de reports de pollen entre les différents croisements.
   4. Liaison panicule: Après la castration, sélectionnez 3-4 panicules sur le parent mâle qui fleuriront le lendemain. Liez-les avec la panicule émasculé du parent femelle utilisant une ligature. Placez la panicule émasculé légèrement en dessous de la panicule du parent mâle. Placez un sac de cristal sur les panicules et fixer le sac à la base avec un trombone. Ceci peut être réalisé le jour 2 fois les panicules du parent mâle commencent la floraison.
   5. Au cours de la période de floraison dans la matinée du jour 2 et jour 3, film ou secouer le sac de cristal pour facipollinisation liter. Continuer à feuilleter ou secouer panicules toutes les 15 minutes pendant toute la durée de la floraison dans la matinée (entre 09h00-11: 00 heures). Retirer panicules de parent mâle après la pollinisation et étiqueter le côté opposé des fleurs épanouies sur la panicule émasculé. Notez le nombre de fleurs épanouies sur la panicule de chaque parent femelle.
7. Une fois la pollinisation a été effectuée, placer un sac de pain micro-perforé sur mesure pour couvrir la panicule du parent femelle et garantir à la base en utilisant une ligature après la pollinisation jusqu'à la récolte de graines.

5. Semences de récolte

1. graines de la récolte au bout de 2 semaines (14-16 jours) à compter du jour de la pollinisation. Placez l'étiquette dans le même sac des graines. Les graines qui ont des marques rouges sur les deux côtés représentent les graines qui ont résulté de la croix génétique contrôlée. Ceux-ci sont censés être retrempe descendance.
2. Jetez les graines sans marques rouges car ils représententles graines qui résultent de fleurs nouvellement développés après la castration. Graines avec des marques rouges sur une seule face représenteront probablement les graines issues de l'auto-pollinisation car ils n'étaient pas en fleurs au moment où les croisements contrôlés ont été effectués.
3. Les graines sèches à 30 ° C pendant 2 jours dans un séchoir à graines. Séché magasin de graines dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) ou dans une chambre de semences (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, humidité relative: 20% ± 1%).

Résultats

Dans cette étude, nous avons utilisé la séquence S. viridis adhésion A10.1 comme parent femelle, et un S. transgénique ligne viridis (également A10.1) contenant le gène rapporteur GUS ⁴ comme parent mâle pour tous les pollinisations. Un régime de croissance optimisée a été utilisé pour synchroniser la floraison comme représenté sur la figure 1. Nous avons testé plusieurs combinaisons de température et le temps de traitement thermique pour la castration et observé qu'environ 40-80% des fleurs retenues sur la panicule émasculé fleuri sur le 2 ^ème jour, alors que le reste a fleuri sur le 3 ^ème jour (Figure 2). Toutefois, si le traitement thermique était trop sévère, pour un exemple, 49 ° C pendant 4 min, très peu ou pas de fleurs a fleuri sur le 2 ^ème jour. Pollinisation croisée a été réalisée sur la 2 ^e ou 3 ^e jour après la castration, qui dépendait de l'heure de pointe de la floraison des parents de sexe masculin.

Il était observableed que les jeunes fleurs ont continué à se développer après la castration, mûri et l'auto-pollinisation pollinisation 3-6 jours après contrôle. Après 7-10 jours après la pollinisation, les fleurs qui sont de couleur blanche sont visibles sur la panicule. Ces fleurs blanches ne sont pas fécondés en raison soit de dommages de la chaleur ou une mauvaise pollinisation. Dans le même temps, les fleurs qui ont été pollinisées avec succès commencent à porter leurs graines sombres et commencer à briser après 14 jours. Les graines noires avec des marques rouges récoltés sur le 14 ^e jour après la pollinisation pourraient être clairement distingués des graines sans marques rouges qui étaient encore vertes et ne se brisent. Si la récolte est retardée, la anthecium des graines avec et sans taches rouges à la fois tourner sombre, ce qui rend difficile de distinguer rapidement les graines avec des marques rouges dans les piscines récoltés.

Afin d'optimiser le protocole de traversée de plusieurs expériences de traitement thermique ont été réalisés comme le résume le tableau 1. Une moyenne de0 à 10 grains / panicule ont été récupérés à partir de différentes expériences de traitement thermique. Après la récolte, les graines ont été séchées à 30 ° C pendant 2 jours dans un séchoir à graines, suivie par l'élimination de la anthecium l'aide d'un solvant de anthecium. Après la anthecium a été retiré, les graines F1 putatifs ont été colorées avec une solution de coloration GUS, et la descendance retrempe colorées couleur bleue dans 1-2 heures (figure 2F). Sur la base de ces résultats, nous recommandons un traitement thermique de 48 ° C pendant 3-6 min. En outre, nous recommandons que les croisements sont effectués à la fois sur les jours 2 et 3 ci-dessous émasculation.

D'examiner l'efficacité de cette technique dans l'exécution de croix avec d'autres adhésions Setaria ou des espèces, des croisements entre S. viridis A10.1 et huit diversifiée S. adhésions viridis et un S. pumila adhésion ont été réalisées. Bien jours à la floraison variée parmi les accessions nous avons trouvé que les fleurs de tous les huit S. adhésions viridis et un S.pumila adhésion commencent ouverture entre 10h00-11h00 avec un temps d'ouverture de pic à 10:20-11:00 après le traitement par le froid avant l'aube. Ceci indique que le traitement à froid avant l'aube peut être appliquée à divers Setaria adhésions. Un traitement thermique de 48 ° C pendant 5-6 min a été utilisé pour émasculer S. viridis A10.1 qui a été utilisé comme parent femelle pour tous les croisements effectués. Nous avons récupéré de l'un à 12 graines de croisements entre A10.1 et trois de la diversité S. adhésions viridis et six graines d'un seul croisement entre S. viridis A10.1 et un seul S. adhésion pumila. Cependant, à ce moment, nous n'avons pas déterminé si ces semences résulte d'une testcross succès ou sont le résultat de l'auto-contamination. Quoiqu'il en soit, ces résultats préliminaires suggèrent que les conditions de croissance utilisées pour S. viridis A10.1 peut être utilisé pour générer des croisements avec divers S. adhésions viridis et éventuellement d'autres espèces de Setaria.

Temp traitement thermique (° C)	Temps traitement thermique, (min)	# croix	Moy. Nombre de fleurs après garniture	Jour de la pollinisation (jour après emasc)	Moy. # graines (rouge) / panicule (moyenne)	Moy. Gus% (+) / graines (rouges)	Moy. # Graines de hyb (Gus +)	Min # hyb graines	Max # hyb graines
47	10	2	27	2ème jour	0	0	0	0	0
48	3	3	36	2ème jour	5	60	3	1	5
	4	3	25	3ème jour	10	50	5	3	7
	5	8	25	2ème jour	5	60	3	1	6
	6	3	25	2ème jour	4	75	3	0	4
	7	4	24	2ème jour	3	33	1	0	4
	7	1	25	3ème jour	4	75	3	N / A	N /A
49	1	3	23	2ème jour	5	25	1	0	2
	2	7	26	2ème jour	8	25	2	0	4
	3	5	22	2ème jour	0	0	0	0	1
	4	4	25	2ème jour	0	0	0	0	0

Tableau 1. Optimisation du traitement thermique de la castration. Résultats de modifier à la fois la température et le temps de traitement thermique. Pollinisations ont été réalisées un ^(2ème jour) ou deux jours (3 ^ème jour) après la castration et croisements réussis sfourrés coloration GUS

Figure 1. Optimisé conditions de la chambre de croissance avec une température et des périodes de temps pour une croissance optimale et la synchronie de la production de fleurs avant l'aube traitement par le froid. Sont indiqués. Les flèches vertes et rouges indiquent fenêtre optimale pour effectuer les croisements et la castration, respectivement.

Figure 2. préparation de la panicule de passage et la coloration GUS de descendance retrempe. (A) Une panicule de Setaria viridis A10.1 avant de couper, montrant environ 1/10 de fleurs ouvertes. Les quatre sections et directivité dans la progression de la floraison le long de la panicule est montré. (C) Une panicule émasculé après l'enlèvement de poils. (D) Une panicule émasculé le jour 2 post-castration, montrant des fleurs qui fleurissent (photo prise à 10h30 AM). (E) Une panicule de parent mâle (Setaria viridis transgénique de la ligne de A10.1 portant une β-glucuronidase (GUS) gène rapporteur) qui est en pleine floraison après le traitement avant l'aube (photo prise à 10h30). A à E, barres d'échelle = 1 mm (F). progéniture retrempe putatif après coloration GUS pendant 2 heures suivi par distaining à 70% (v / v) d'éthanol. Les deux graines de la droite sont des témoins négatifs et positifs, respectivement.

Figure 3. Organigramme du protocole Une représentation schématique de la métapes AJOR impliqués dans l'exécution de S. viridis traverse.

Discussion

Importance du traitement avant l'aube

Pour obtenir une fréquence élevée de descendance retrempe il est essentiel d'avoir la floraison très synchrone des parents masculins et féminins. Initialement, nous roulions régimes de température et de lumière (31 ° C/22 ° C, jour / nuit) et utilisé le S. viridis adhésion A10.1 pour tous les pollinisations. Dans ces conditions, la plupart des fleurs s'ouvrent tôt le matin avant que la température monte à 31 ° C, bien que quelques fleurs s'ouvrent de façon aléatoire entre 08h00-8: 12 heures. Des études antérieures dans S. italica indiquent que l'heure du jour, le lieu et la saison contribuent à la variation de l'anthèse ^7,15,16. Siles et al. ⁶ noté que la floraison a été associée à des changements rapides de température et d'humidité, mais pas à basse température et une humidité élevée, en soi, comme l'a conclu dans des études antérieures ^7,15. Par conséquent, nous avons utilisé un traitement par le froid avant l'aube du 15 ° C pendant 30 min (à partir de 8:30 AM-9: 00 heures) pour imiterl'état naturel avant l'aube. Ce traitement par le froid avant l'aube aidé à synchroniser la floraison chez les parents. Nous avons observé que, malgré la mise de la chambre pour les niveaux d'humidité relative de 50%, l'humidité relative à l'intérieur de la chambre augmente jusqu'à un niveau supérieur à 70% lorsque la température est passée de 22 ° C à 15 ° C et a continué à rester au-dessus de 70% jusqu'à ce que la température progressivement augmenté à 31 ° C après 09h30. A 09h00, émasculé parents femelles et plantes de parent mâle sont amenés au laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%). Fleurs des parents mâles commencent ouverture autour de 10h10, et la pollinisation peuvent être effectués à 10h30-11: 00 heures. Une liste détaillée de tous les réactifs et le matériel est fourni dans le tableau 2.

Importance de la préparation de la panicule pour émasculation

Dans les conditions de la chambre dans cette étude (figure 1), la durée de floraison de la panicule primaire variait de2-3 jours. Typiquement, les fleurs situés sur le milieu distale de l'inflorescence (Figure 2A) et la première ouverture ouverte précède proximale et distale. Le nombre idéal de fleurs à retenir sur la panicule est de 20-30. Il faut être prudent lors de l'enlèvement des fleurs immatures de sorte que seules les fleurs bien développées (la fleur la plus haute ou plus grands sur l'épillet ¹⁷⁾ sont conservés. Étiquetage avec un marqueur rouge sur les deux côtés des fleurs permet de distinguer efficacement progéniture retrempe putatif à partir de graines de fleurs nouvellement développés après la castration. En outre, il est important de laisser les poils sur les panicules avant émasculation pour protéger les fleurons de dommages importants à la chaleur, mais comme une option, ils peuvent être enlevés après la castration à l'aide des ciseaux à ressort pour faciliter la pollinisation, en particulier lors de la liaison d'une panicule technique est utilisée (figures 2C et 2D).

Optimisé une températurela durée du traitement de d pour le traitement de l'eau tiède

La base de l'émasculation par trempage de l'eau chaude est que le pollen est plus sensible à la chaleur que la surface du stigmate. Toutefois, la durée et la température de traitement thermique peuvent varier selon les espèces et les adhésions Setaria. En général, une température plus élevée avec un temps de traitement plus courts ou plus basse température avec une durée de traitement plus longue aura le même effet sur la castration. Il a été rapporté qu'un traitement thermique de 42 ° C pendant 20 min ^{à 10} ou 47 ° C pendant 10 min ¹⁴ rendu S. italica pollen non viable, mais l'efficacité de ces traitements n'a pas été déterminée. Nous avons développé notre protocole suivant l'hypothèse que, sous une température optimale et la durée du traitement, le pollen de toutes les fleurs retenue sur le parent femelle sera non viable tout stigmates resteront ouverts. Cependant, après la comparaison et l'analyse des effets de plusieurs températures etpériodes de traitement (tableau 1), nous avons constaté que la sensibilité au traitement thermique varie parmi les fleurs retenues sur chaque panicule, donc il est difficile d'éliminer complètement graines issues de l'auto-pollinisation. Nous concluons que l'efficacité de production de la descendance retrempe est le plus grand lorsque les traitements sont effectués à 48 ° C pendant 3-6 min dans S. viridis adhésion A10.1.

Heure de pointe de la floraison et la pollinisation croisée

Quand les fleurs arrivent à maturité et sont sur ​​le point d'ouvrir, anthères sont blanc jaunâtre et le pollen est libéré dès que les anthères exsert des fleurs ^8. Anthères se tournent progressivement brun après la libération du pollen que les fleurs commencent à se fermer. Une fois libérée, la viabilité du pollen est inconnue. Par conséquent, il est essentiel d'utiliser le pollen de l'ouverture ou des fleurs fraîchement ouvertes sur le parent mâle le plus tôt possible. Dans nos conditions de chambre (figure 1), la majorité des flowers des parents mâles commencent à s'ouvrir à 10h10 et les fleurs ouvertes apportent le pollen à 10h30. Ainsi, la fenêtre souhaitable pour effectuer la pollinisation est 10:30-11:00. Les stigmates restent en dehors des glumes après fleurs se ferment et peuvent être réceptif au pollen. Cela a déjà été observé et confirmé dans S. italica que les stigmates sont réceptifs pendant environ 48 heures après l'ouverture des fleurs par Siles et al. ^6, il est donc important de sac panicules après le traitement thermique et après avoir effectué des croisements contrôlés. Comme indiqué plus haut, nous recommandons pollinisations performants à la fois sur Jour 2 et Jour 3 post-castration.

Méthodes pour la pollinisation

Nous avons comparé l'efficacité de trois techniques de pollinisation. Si la floraison des fleurs ne sont pas limitatifs, la pollinisation panicule à panicule est la technique la plus efficace et donnera un plus grand nombre de descendants retrempe. Si panicules fleurissent limitent, une fréquence plus élevée de outcross progéniture sera produit lorsque la méthode anthères à la stigmatisation est utilisé. Nous avons obtenu la descendance retrempe des deux méthodes avec succès. La méthode «panicules de liaison" a été utilisé dans la traversée S. italica ⁶ mais nous avons trouvé que cette méthode soit la méthode la moins efficace que la fenêtre de temps pour la libération du pollen du parent mâle est courte. En outre, il ya moins de contrôle sur la pollinisation et les poils sur S. panicules viridis peuvent également entraver la circulation du pollen sur le stigmate.

Graine récolte, de séchage et de stockage

Après la récolte, les graines doivent être séchés à 30-33 ° C pendant 2 jours. Anthecium devraient être supprimés pour la coloration GUS, si nécessaire. Les graines doivent être stockés dans un endroit frais et sec (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) pour le stockage à court terme (moins de deux ans) ou dans une chambre de semences (T: 4.0 10 ° C ± 1,0 ° C, humidité relative: 20% ± 1%) pour un stockage à long terme.Mauvaises conditions de stockage peuvent entraîner des taux de viabilité faible ^8. Nous avons observé que le taux de germination de S. viridis A10.1 est d'environ 5% lorsque ensemencées 4 jours après la récolte, mais peut être augmentée de 90 à 96% après stockage dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%) pour 110 jours post-récolte suivie d'une stratification de trois jours à -80 ° C pour lever la dormance des semences. Pour la stratification à -80 ° C, les graines sèches peuvent être placés dans un récipient étanche à l'air (par exemple, des tubes de micro-centrifugeuse ou d'une enveloppe de pièces de monnaie dans un sac en plastique scellé) et conservés à -80 ° C pendant 3 jours avant la plantation. Après 16 mois de stockage dans le laboratoire (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidité relative: 21,79% ± 1,15%), les pourcentages de germination de 90-95% peuvent encore être obtenus. En outre, pour rompre la dormance, les graines peuvent être séchés à 30-33 ° C pendant 2 jours après la récolte, et ensuite remis stratification de trois jours à -80 ° C suivie de l'élimination deanthecium avant la plantation. Après ces traitements, semences taux allant jusqu'à 33% de germination peuvent être atteints.

Avantages, limites et modifications possibles

Ici, nous fournissons le premier protocole standard pour effectuer des croisements en S. viridis A10.1 à l'aide d'un traitement thermique pour la castration. Contrairement à la castration physique, ce protocole est moins invasive et relativement facile à mettre en place dans un laboratoire. Cela prend habituellement environ 15 min pour couper un panicule et environ 15 panicules peut être coupé et traversé / personne / jour. En supposant une moyenne de 3-5 retrempe progéniture / panicule peut être récupéré dans des conditions optimisées, un total de 45 à 75 retrempe descendance peut être produite par une personne en un seul jour. En outre, cette technique peut être appliquée à d'autres espèces en croix Setaria, bien que des optimisations supplémentaires seront susceptibles. Si l'espace de la chambre de croissance est limitée, les plantes peuvent être cultivées en serre ou chambres de croissance sans traités avant l'aubetiment jusqu'à la panicule émerge avant qu'ils ne soient transférés dans les conditions de la chambre optimisés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux, ressort	World Precision Instruments, Inc	14126
Pinces, Dumostar Biology Polished	SPI Supplies	TD5BP-XD
Ciseaux chirurgicaux	F.S.T (Fine Science Tools)	14005-12
Europack Sacs à pain croustillants micro-perforés en polypropylène transparent 6"x28 »	http://www.pjpmarketplace.com	361001
Flats	T.O. Plastics	715401C
metro mix 360	Hommert International	10-0356-1
Jack’s 15-16-17	Hommert International	07-5925-1
Kimwipes	VWR International	34120
Sharpie Marqueurs permanents à pointe ultra fine,	agrafes	37002
Donegan DA-10 OptiVisor Loupe serre-tête, grossissement 3,5x, distance focale 4 »	Amazon	DA-10, B0015IP380
12"24/7 Emballage Main Impulse Sealer Machine de thermoscellage Poly Sealing Free Element Grip	Amazon	N/A
bain-marie	Modèle scientifique VWR	: 1166
BDW Walk in chambre de croissance végétale	Conviron	BDW 40