Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Résumé

Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca ^{2 +,} la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.

Résumé

Blessures de la membrane plasmatique est un événement fréquent, et les plaies doivent être réparés rapidement pour assurer la survie cellulaire. Influx de Ca ^{2 +} est un événement de signalisation clé qui déclenche la réparation de plaies mécaniques de la membrane de plasma à l'intérieur ~ 30 sec. Des études récentes ont révélé que les cellules de mammifères reboucher aussi leur membrane plasmique après perméabilisation de formation de pores toxines dans un processus ^{2 +-dépendante} Ca implique que l'exocytose de la sphingomyélinase acide enzyme lysosomale suivie pores endocytose. Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer que la refermeture de cellules perméabilisées par la toxine Streptolysine O est aussi rapide et dépend influx de ^{Ca2 +.} Le design de dosage permet la synchronisation de l'événement de blessure et une mesure cinétique précise de la capacité des cellules à restaurer l'intégrité de membrane plasmique par l'imagerie et la quantification de la mesure dans laquelle le colorant lipophile FM1-43 atteint les membranes intracellulaires. Ce concert als essaio sensible permet une évaluation de la capacité des facteurs solubles ajouté de manière exogène, tels que la sphingomyélinase pour inhiber l'influx FM1-43, ce qui reflète la capacité des cellules à réparer leur membrane plasmique. Ce test a permis de montrer pour la première fois que la sphingomyélinase agit en aval de Ca ^{2 +-dépendante} exocytose, puisque l'addition de l'enzyme extracellulaire favorise la refermeture de cellules perméabilisées en l'absence de Ca ^{2 +.}

Introduction

Il est connu depuis plusieurs décennies que la réparation de la membrane plasmatique après une lésion mécanique est un ^1,2 Ca ^{2 +} de procédé dépendantes. Des études ultérieures ont montré que l'influx de ^{Ca2 +} à travers la plaie déclenche un processus dynamique de l'exocytose de vésicules intracellulaires au niveau du site de lésion, qui est nécessaire pour resceller ^3,4. Le taux de perte d'un colorant fluorescent chargé dans le cytoplasme des cellules a été utilisé pour évaluer la vitesse de réparation, et a conclu que rescellement a été achevée à l'intérieur de <30 s après la lésion ^5. Deux modè....

Protocole

Une. Transcriptionnelle de l'ASM

1. Graine de 1,5 x 10 ⁵ cellules HeLa dans 2 ml de milieu de culture DMEM (DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1% de Penn-Strep) sur des plats de fond 35 mm en verre (MatTek) et incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%.
2. Le jour suivant, aspirer hors des milieux de croissance et de la remplacer par 2 ml du milieu DMEM réduite de sérum (DMEM avec du FBS à 4%), au moins 1 heure avant d'ajouter le mélange de transfection de siRNA.
3. Préparer 4 tubes pour le mélange de transfection oligo siRNA. Dans les tubes A et C, ajouter 2....

Résultats

De faibles concentrations de bactéries sphingomyélinase (SM) sauvetage réparation de la membrane plasmatique dans des cellules appauvries en sphingomyélinase acide lysosomale.

En utilisant le test de formation d'image FM1-43, nous avons précédemment montré que des cellules déficientes pour l'ASM enzyme lysosomale et exposés à SLO blessant en présence de Ca ^{2 +} ont un défaut de la membrane plasmique est recueilli par addition extracellulaire de l'enzyme humaine recombinant.......

Discussion

Des études antérieures sur blessure mécanique et la membrane plasmique réparation invoqués divers mécanismes de cellules blessant, allant de l'abandon des perles de verre, micropipetage, cisaillement, gratter ou racler. La lecture de tous ces essais était qualitative plutôt que quantitative, et ne donne pas d'informations précises sur la cinétique du mécanisme de réparation. La capacité des cellules à resceller leur membrane plasmique après ces formes de lésion a été mesurée en présence ou en l'absence de tr.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactif
HeLa 229 lignée cellulaire	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Teneur en GC moyen témoin RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 ARNi oligo	Invitrogen	HSS143988
Sérum de veau fœtal	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomamyélinase de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Plats à fond en verre de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscope inversé	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscope confocal à disque rotatif	PerkinElmer	UltraViewVoX
Analyse du logiciel logiciel	PerkinElmer	Volocity Suite
Chambre environnementale	Dispositifs de pathologie	Chambre

Inactivé par la chaleur système LiveCell