Vivre Imaging test pour évaluer les rôles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et Sphingomyélinase dans la réparation des pores formant blessures à toxines

Résumé

Imagerie en temps réel des cellules exposées au colorant lipophile FM1-43 permet une détermination précise de la cinétique par lequel les toxines formant des pores sont enlevés de la membrane plasmique. Il s'agit d'un test sensible qui peut être utilisée pour évaluer les exigences de Ca ^{2 +,} la sphingomyélinase, et d'autres facteurs de réparation de la membrane plasmatique.

Résumé

Blessures de la membrane plasmatique est un événement fréquent, et les plaies doivent être réparés rapidement pour assurer la survie cellulaire. Influx de Ca ^{2 +} est un événement de signalisation clé qui déclenche la réparation de plaies mécaniques de la membrane de plasma à l'intérieur ~ 30 sec. Des études récentes ont révélé que les cellules de mammifères reboucher aussi leur membrane plasmique après perméabilisation de formation de pores toxines dans un processus ^{2 +-dépendante} Ca implique que l'exocytose de la sphingomyélinase acide enzyme lysosomale suivie pores endocytose. Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour démontrer que la refermeture de cellules perméabilisées par la toxine Streptolysine O est aussi rapide et dépend influx de ^{Ca2 +.} Le design de dosage permet la synchronisation de l'événement de blessure et une mesure cinétique précise de la capacité des cellules à restaurer l'intégrité de membrane plasmique par l'imagerie et la quantification de la mesure dans laquelle le colorant lipophile FM1-43 atteint les membranes intracellulaires. Ce concert als essaio sensible permet une évaluation de la capacité des facteurs solubles ajouté de manière exogène, tels que la sphingomyélinase pour inhiber l'influx FM1-43, ce qui reflète la capacité des cellules à réparer leur membrane plasmique. Ce test a permis de montrer pour la première fois que la sphingomyélinase agit en aval de Ca ^{2 +-dépendante} exocytose, puisque l'addition de l'enzyme extracellulaire favorise la refermeture de cellules perméabilisées en l'absence de Ca ^{2 +.}

Introduction

Il est connu depuis plusieurs décennies que la réparation de la membrane plasmatique après une lésion mécanique est un ^1,2 Ca ^{2 +} de procédé dépendantes. Des études ultérieures ont montré que l'influx de ^{Ca2 +} à travers la plaie déclenche un processus dynamique de l'exocytose de vésicules intracellulaires au niveau du site de lésion, qui est nécessaire pour resceller ^3,4. Le taux de perte d'un colorant fluorescent chargé dans le cytoplasme des cellules a été utilisé pour évaluer la vitesse de réparation, et a conclu que rescellement a été achevée à l'intérieur de <30 s après la lésion ^5. Deux modèles ont d'abord été proposés pour expliquer la nécessité d'exocytose dans la réparation de la membrane plasmique: 1) le modèle de «patch», ce qui suggère que influx de ^{Ca2 +} à travers la lésion déclenche fusion initialement homotypique des vésicules intracellulaires, formant un grand "patch" qui serait ensuite être appliquée sur la membrane plasmique de refermer la plaie ⁶ et 2) le modèle de réduction de la tension, qui a proposé que la membrane Added par Ca ^{2 +-dépendante} exocytose dans le voisinage de la blessure serait de réduire la tension de la membrane plasmatique, ce qui facilite refermeture de la double couche ^7. Le rôle de Ca ^{2 +} exocytose déclenchée dans le plasma réparation de la membrane a été renforcée par des études montrant que les lysosomes contiennent une molécule Ca ^{2 +} du capteur, synaptotagmine VII, ce qui facilite leur exocytose et plasma réparation de la membrane dans les cellules lésées ^8,9,10,11 .

Toutefois, une preuve supplémentaire a indiqué que l'exocytose seul n'était pas suffisant pour promouvoir plasma réparation de la membrane. En plus de larmes mécanique sur la membrane plasmique, une forme fréquente de lésion cellulaire est la perméabilisation par les toxines formant des pores produits par des bactéries ou des cellules immunitaires ^{12,13 14,15.} Contrairement aux déchirures mécaniques, des protéines formant des pores s'insèrent sur la membrane plasmique de formage, une protéine de pore bordée stable qui ne peut être refermé simplement en appliquant une membrane "patch" ou par réductionment la tension de la membrane. Curieusement, des études ont révélé que les cellules de mammifères possèdent un mécanisme efficace pour la réparation de leur membrane plasmique après perméabilisation avec des protéines formant des pores, ce procédé nécessite également la présence de Ca ^{2 +} extracellulaire ^12. Cette découverte a soulevé la question de savoir si le retrait transmembranaire des pores de la surface de la cellule a également été un processus rapide, comme on l'observe avec des blessures mécaniques ^5. De manière surprenante, les études récentes ont révélé que la refermeture de cellules perméabilisées avec des toxines formant des pores a des propriétés très similaires à la réparation des plaies mécaniques: le procédé nécessite le ^{Ca2 +} extracellulaire, et est achevée dans ~ 30 sec. Enquêter sur ce processus plus en détail, nous avons récemment appris que, en plus de Ca ² exocytose ⁺ réglementés des lysosomes, la réparation de la membrane plasmique implique une forme rapide de l'endocytose, qui est déclenchée par la libération de l'enzyme lysosomale sphingomyelinase acide (ASM) et est essentiel non seulement pour ee retrait de pores transmembranaires, mais également pour la réparation de plaies mécaniques ^16.

Pour déterminer la cinétique de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, dans notre laboratoire, nous avons adapté une méthodologie d'imagerie en temps réel qui a été utilisée précédemment pour évaluer refermeture de fibres musculaires isolées laser blessé ^17. Ce dosage repose sur les propriétés du colorant lipophile FM1-43, qui s'intercale de manière stable dans le feuillet externe de bicouches lipidiques augmentation de l'intensité de fluorescence. Lorsque le plasma membrane bicouche est perturbé gains de colorant extracellulaire accès à des membranes intracellulaires, en fournissant un dosage sensible pour détecter un dommage de la membrane plasmique et réparer ^18,16,19,20. Afin d'adapter ce test pour l'évaluation de la refermeture après perméabilisation des cellules avec des protéines formant des pores, on les cellules pré-incubées à 4 ° C avec la toxine bactérienne streptolysine O (SLO), qui se lie à la membrane ²¹ de cholestérol. Cellule synchroneperméabilisation peut alors être facilement réalisé en déplaçant les cellules à partir de la glace se réchauffer milieu dans une platine de microscope chauffée, ce qui active l'oligomérisation et le changement de conformation qui conduit à la formation de pores transmembranaires. Un avantage de cette approche, au cours des essais publiés précédemment à l'aide de la blessure au laser, est qu'un grand nombre de cellules peuvent être analysées simultanément dans un champ microscopique, offrant un meilleur échantillonnage de la population de cellules. Compte tenu des similitudes entre le processus mécanistes de refermeture de la cellule vu après une blessure mécanique et perméabilisation des toxines formant des pores, le test que nous décrivons ici fournit une méthode très puissante et polyvalente pour des facteurs impliqués dans le processus fondamental de plasma réparation de la membrane de dissection. A titre d'exemple, on montre qu'il est possible d'utiliser ce dosage pour identifier les mesures de ^{Ca2 +} dépendants et indépendants du processus de réparation.

Protocole

Une. Transcriptionnelle de l'ASM

1. Graine de 1,5 x 10 ⁵ cellules HeLa dans 2 ml de milieu de culture DMEM (DMEM riche en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 1% de Penn-Strep) sur des plats de fond 35 mm en verre (MatTek) et incuber une nuit à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%.
2. Le jour suivant, aspirer hors des milieux de croissance et de la remplacer par 2 ml du milieu DMEM réduite de sérum (DMEM avec du FBS à 4%), au moins 1 heure avant d'ajouter le mélange de transfection de siRNA.
3. Préparer 4 tubes pour le mélange de transfection oligo siRNA. Dans les tubes A et C, ajouter 250 ul de Optimem sérum réduit et 4 ul de Lipofectamine RNAiMax, par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube B, ajouter 250 ul de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de contrôle du contenu de GC moyen oligo (siRNA contrôle), par boîte de 35 mm à transfecter. Dans le tube D, ajouter 250 microlitres de sérum Optimem réduits et 8 pi (160 pmol) de SMPD1 oligo (siasme), par boîte de 35 mm to transfecter. Incuber les tubes à température ambiante pendant 5 min.
4. Mélanger les tubes A et B pour former le complexe de transfection pour le contrôle des siRNA, et les tubes C et D pour l'ASM siRNA. Incuber les réactions à la température ambiante pendant 20 min.
5. Ajouter les mélanges de réaction de transfection de siRNA contrôle et ASM siARN lentement, goutte à goutte, dans des plats de 35 mm de fond verre respectives et incuber à 37 ° C / 5% CO _2. À 24 h post-transfection, aspirer délicatement les médias et le remplacer par un milieu de croissance de DMEM frais. Pour ASM efficace knockdown, les plats doivent être encore incubées à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant environ 31 heures (total 55 heures) avant l'imagerie en direct.

2. Préparation des réactifs pour la microscopie en direct

1. Préparer une solution de toxine formatrice de pores recombinant streptolysine O (SLO) à une concentration de 100 ng / ul dans du PBS froid 1x sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.} Le SLO utilisé dans ces essais est un constitutively mutant cystéine actif qui ne nécessite pas d'agents pour réduire l'activité, aimablement fourni par le Dr Rod Tweten, Université de l'Oklahoma. La toxine a été exprimée dans E. coli BL21 DE3 et purifiée dans des conditions natives, comme décrit précédemment ^16.
2. Préparer la solution mère FM1-43: Remettre en suspension FM1-43 poudre lyophilisée dans du DMSO pour créer une solution de 25 mM.
3. Préparer la solution A: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid avec Ca ^{2 +} à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml sont nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
4. Préparer la solution B: Diluer la solution mère FM1-43 dans du DMEM froid sans Ca ^{2 +} et 10 mM d'EGTA ^(Ca2 DMEM ⁺ gratuit) à une concentration finale de 4 pm (1,5 ml nécessaires par boîte MatTek) et stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
5. Pré-chaude (37 ° C) aliquotes de 1 ml de la solution A et la solution B dans des tubes Eppendorf.
6. Gardez sur des solutions de glace de DMEM avec Ca ^{2 +,} et Cun DMEM ^{2 +} libre.

3. Imagerie de cellules vivantes FM1-43 Afflux en SLO traités et les cellules non traitées

1. Remplir un récipient métallique peu profond de taille moyenne avec de la glace pilée, l'inverser dans un grand récipient en verre avec de la glace, et ajouter de la glace supplémentaire ne laissant que la surface de fond du récipient métallique exposée. Placez une serviette de papier humide sur le fond de métal exposé pour permettre le transfert thermique même.
2. Prenez un plat MatTek contrôle siRNA traité (échantillon 1) et placez-le sur la serviette en papier humide froid. Aspirer tous les médias et laver 3 fois avec froid Ca ^{2 +} sans DMEM. Après le dernier lavage, aspirer hors tous les médias dans le plat.
3. Pour créer une image associée aux cellules FM1-43 dans des cellules qui n'ont pas la blessure SLO (échantillon 1), en présence de Ca ^{2 +,} ajouter 180 ul de solution froide B à la lamelle de verre centrale de la coupelle inférieure 35 mm verre et incuber pendant 5 min sur de la glace (tableau 1).
4. Placez plat MatTek sur la scène d'un microscope confocal chauffé à 37 ° C et équipé d'une chambre environnementale (qui maintient la température, l'humidité et niveaux _de CO _2). Trouver le domaine des cellules qui seront imagés en regardant à travers un 40X NA 1.3 objectif (Nikon). Si possible, mettez PerfectFocus ou un dispositif similaire à corriger la dérive thermique.
5. Ajouter 1 ml de solution A préchauffé doucement sur ​​le côté de la boîte de 35 mm et remettre le couvercle de la chambre de l'environnement (tableau 1).
6. Acquérir les images de 4 min à 1 image toutes les 3 secondes en utilisant un logiciel d'imagerie approprié (Volocity dans le système de filage de la microscopie confocale UltraView disque Vox Perkin Elmer). L'excitation du FM1-43 est effectuée avec un rayon laser de 488 nm en utilisant un filtre dichroïque avec un passe-bande de 488 nm, et la discrimination d'émission est réalisée par utilisation d'un filtre 527 (W55) d'émission. des niveaux de puissance de laser et de la sensibilité de la caméra sont réglés pour réaliser des expositions d'image de 100 msec.
7. Répétez les étapes 3.2 à 3.6 pour détecter FM1-43 dans les cellules traitées siRNA contrôle sans blessure SLO (échantillon 2) en l'absence de Ca ^{2 +,} sauf que lors de l'étape 3.5 Solution B devrait être ajouté (tableau 1).
8. Pour mesurer FM1-43 flux dans des cellules de contrôle siRNA traités blessées avec SLO soit en présence (échantillon 3) ou en l'absence de Ca ^{2 +} (échantillon 4), ajouter 180 ul de froid la solution B contenant SLO à la lamelle de verre centrale de la 35 mm plat à fond de verre et incuber pendant 5 min sur la glace que dans l'étape 3.3. Répétez les étapes 3.2 à 3.6; ajuster ajoutant soit la solution A ou la solution B à l'étape 3.5 (tableau 1).
9. Pour déterminer le rôle de l'ASM dans le plasma réparation de la membrane, répétez les étapes 3.2 à 3.6 en utilisant des cellules de siARN traité ASM pour toutes les conditions (échantillons 5-8) (Tableau 1).
10. Pour déterminer le rôle de la sphingomyélinase extracellulaire recombinant (SM) sur lacinétique de réparation de la membrane plasmatique (réfléchis par l'inhibition de l'afflux FM1-43) (échantillons 9 à 10), on ajoute SM (0-50 uU) soit à la solution A ou la solution B à l'étape 3.5, et ensuite ajoutés aux cellules pendant cellules vivantes imagerie dans un volume total de 1 ml (tableau 1).

4. Quantification de FM1-43 Afflux dans les cellules

1. Après films ont été acquis, mesurer l'intensité de fluorescence intracellulaire de FM1-43 en utilisant un logiciel d'analyse d'image (Volocity Suite, PerkinElmer). Tirage d'une région d'intérêt dans la région cytosolique de chaque cellule dans le champ et à appliquer les outils logiciels pour déterminer la moyenne FM1-43, l'intensité de fluorescence dans toutes les trames de la vidéo.
2. Pour tenir compte des variations dans la première FM1-43 coloration, les données de chaque vidéo est exprimé en pli augmentation de l'intensité de fluorescence au cours du temps, et tracées pour chaque condition différente. Le facteur d'augmentation de la fluorescence de chaque heure individuelle parcellule est calculé comme F _T / F _0, où F _T est la fluorescence moyenne au point de temps spécifique, et F ₀ est la fluorescence moyenne à t = 0 (Figures 1-2).

Résultats

De faibles concentrations de bactéries sphingomyélinase (SM) sauvetage réparation de la membrane plasmatique dans des cellules appauvries en sphingomyélinase acide lysosomale.

En utilisant le test de formation d'image FM1-43, nous avons précédemment montré que des cellules déficientes pour l'ASM enzyme lysosomale et exposés à SLO blessant en présence de Ca ^{2 +} ont un défaut de la membrane plasmique est recueilli par addition extracellulaire de l'enzyme humaine recombinant...

Discussion

Des études antérieures sur blessure mécanique et la membrane plasmique réparation invoqués divers mécanismes de cellules blessant, allant de l'abandon des perles de verre, micropipetage, cisaillement, gratter ou racler. La lecture de tous ces essais était qualitative plutôt que quantitative, et ne donne pas d'informations précises sur la cinétique du mécanisme de réparation. La capacité des cellules à resceller leur membrane plasmique après ces formes de lésion a été mesurée en présence ou en l'absence de tr...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactif
HeLa 229 lignée cellulaire	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Teneur en GC moyen témoin RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 ARNi oligo	Invitrogen	HSS143988
Sérum de veau fœtal	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomamyélinase de Bacillus cereus	Sigma	S7651
Plats à fond en verre de 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Microscope inversé	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscope confocal à disque rotatif	PerkinElmer	UltraViewVoX
Analyse du logiciel logiciel	PerkinElmer	Volocity Suite
Chambre environnementale	Dispositifs de pathologie	Chambre

Inactivé par la chaleur système LiveCell