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Article de méthode

M. imagerie moléculaire du cancer de la prostate avec un agent de contraste ciblé Petit moléculaire CLT1 Peptide

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DOI :

10.3791/50565

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3 septembre 2013

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1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Translational Hematology & Oncology Research, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University , 3Department of Molecular Biology & Microbiology, Case Western Reserve University

Dans cet article

Résumé

Pour démontrer l'imagerie moléculaire du cancer MR avec un petit peptide agent de contraste IRM spécifique aux protéines de plasma coagulé dans le stroma de la tumeur dans un modèle de cancer de la prostate de la souris ciblé.

Résumé

Tumeur matrice extracellulaire a l'abondance des protéines liées au cancer qui peuvent être utilisés en tant que biomarqueurs pour l'imagerie moléculaire du cancer. Dans ce travail, nous avons démontré l'imagerie moléculaire du cancer de M. efficace avec un petit peptide moléculaire complexe monoamide Gd-DOTA ciblée comme un agent de contraste IRM spécifique ciblé aux protéines plasmatiques coagulé dans le stroma de la tumeur. Nous avons effectué l'expérience de l'évaluation de l'efficacité de l'agent pour la détection non-invasive de tumeur de la prostate par IRM dans un modèle orthotopique de cancer de la prostate PC-3 souris. L'agent de contraste ciblées était efficace pour produire importante amélioration du contraste de la tumeur à une dose faible de 0,03 mmol Gd / kg. Le peptide agent de contraste IRM ciblée est prometteur pour l'imagerie moléculaire M. de tumeur de la prostate.

Introduction

Imagerie efficace de cibles moléculaires liés au cancer est d'une grande importance pour améliorer la précision de la détection du cancer plus tôt et le diagnostic. Imagerie par résonance magnétique (IRM) est un puissant modalité d'imagerie clinique à haute résolution spatiale et aucune ionisation rayonnement 1. Toutefois, aucun agent de contraste cible est disponible pour l'imagerie moléculaire du cancer du MR clinique. Conception et développement de l'innovation d'agents de contraste IRM ciblées seraient grandement progresser l'application de l'imagerie moléculaire du cancer MR. D'importants efforts ont été faits pour développer des agents de contraste pour l'IRM ciblées des biomarqueurs exprimés à la surface des cellules cancéreuses. En raison de relativement faible sensibilité de l'IRM et à faible concentration de ces biomarqueurs, c'est un défi de générer amélioration du contraste suffisant pour l'imagerie moléculaire de M. efficace en utilisant de petits moléculaire des agents de contraste ciblées 2,3. Afin d'obtenir l'amélioration suffisante, divers systèmes de transmission SUCh que des liposomes, des nanoparticules et des polymères conjugués avec une charge utile élevée paramagnétique Gd chélates (III) ont été préparés pour augmenter la concentration locale d'agents de contraste au niveau des sites cibles 4,5. Bien que ces systèmes de délivrance ont été capables de générer de l'amélioration significative de la tumeur dans les modèles animaux, leurs grandes dimensions ont donné lieu à l'élimination lente et incomplète du corps, résultant en une accumulation prolongée de Gd (III) des ions toxiques, qui peuvent provoquer des graves problèmes de sécurité 6. Récemment, certaines études ont montré que les limites de l'IRM pour l'imagerie moléculaire peuvent être surmontés par la sélection des biomarqueurs moléculaires appropriés à haute expression locale dans les lésions et l'utilisation de petits agents moléculaires qui peuvent être facilement excrétés 7,8. La principale caractéristique de ces agents est qu'ils ciblent des marqueurs moléculaires présents abondamment dans les tissus malades avec peu de présence dans les tissus normaux. Une forte concentration d'agents de contraste peut se lier à ces objectifs, entraînant sufficace amélioration du contraste pour l'imagerie moléculaire de M. efficace. Etant donné que leur taille est plus petite que le seuil de filtration rénale, les agents de contraste non liés peuvent être aisément excrétés par le corps avec un bruit de fond réduit. Nous avons sélectionné un biomarqueur universel sur le cancer, les protéines de plasma coagulé, qui existent en abondance dans le stroma de la tumeur, et sont rarement présents dans les tissus normaux 9. Nous avons synthétisé un agent de contraste contenant ciblée un petit peptide de ciblage CGLIIQKNEC (CLT1), qui a montré une forte liaison spécifique pour le modèle de tumeur de la prostate PC3 10, et quatre chélates de monoamides Gd-DOTA. Ici, nous fournissons une méthode pour l'imagerie moléculaire du cancer M. de détecter des tumeurs chez la souris.

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Protocole

Protocole adapté d'une étude préalable 11.

Une. Conjugaison de Gd-DOTA à CLT1 Peptide

  1. En utilisant la synthèse classique de peptides en phase solide, synthèse de peptide CLT1 (CGLIIQKNEC) à partir des acides aminés protégés par Fmoc sur une résine de chlorure de 2-chlorotrityle (1,0 mmol).
  2. Après l'ajout d'acides aminés finale, cycliser le peptide linéaire sur la résine avec du thallium (III) de trifluoroacétate (1,09 g, 2,0 mmol, 2 équivalents) dans du DMF (20 ml) à 0 ° C pendant 2 heures.
  3. Ensuite, le conjugué PEG et la lysine en séquence à l'extrémité N-terminale du peptide CLT1 (1,0 mmol) de résine en faisant réagir séquentiellement avec Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3,0 mmol), et un second lot de Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmol).
  4. Retirer Fmoc avec de la pipéridine. Ajouter DOTA-tris (t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 équivalents par rapport à chaque groupe amino) à réagir avec les amines libres à partir de quatre dendrimère de la lysine sur la résine pendant 2 heures.
  5. Enfin, cliver et déprotéger le produità partir de la résine par traitement avec un cocktail d'acide trifluoroacétique, de l'eau, et triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) pendant 8 heures à température ambiante. Éliminer la résine par filtration suivie d'un lavage avec de l'acide trifluoroacétique (TFA). Ajouter les filtrats combinés goutte à goutte à de l'éther d'éthyle froid (200 ml), centrifugation et lavage à l'éther éthylique 4x. Sécher sous vide pour donner un solide incolore (1,99 g, rendement de 61%).
  6. On purifie le produit brut par HPLC preparative en utilisant un gradient de 0-40% de solvant B (TFA 0,1% dans de l'acétonitrile) dans du solvant A (0,1% de solution aqueuse de TFA) pendant 20 min et de 40 à 90% de solvant B dans le solvant A pendant 10 min, .
  7. Dissoudre CLT1-dl-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) dans de l'eau DI (15 ml) et ajuster le pH à 6 en utilisant 1 M de NaOH. Ajouter Gd (OAc) 3 0,4 H 2 O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 équivalents à DOTA monoamide) en portions à la solution, tout en maintenant le pH à 6 avec 1 M NaOH. Agiter la solution de réaction à température ambiante pendant 48 h.
  8. Complexe Gd résiduel (III) avec ethylenediaminetetraacetic acide acétique (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), et on purifie le produit brut avec une colonne d'exclusion de taille pour donner le produit final CLT1-dl-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%).

2. Caractérisation des agents de contraste

  1. Mesurer Gd (III) contenu par spectroscopie d'émission à plasma à couplage inductif-optique.
  2. Acquérir désorption / ionisation laser à temps de vol (MALDI-TOF) des spectres de masse assistée par matrice en mode linéaire avec de l'acide 2,5-dihydroxybenzoïque (2,5-DHB) comme matrice.
  3. Mesurer les temps de relaxation de la solution aqueuse des agents de contraste de CLT1-dL (Gd-DOTA) 4 et un agent de contrôle non ciblée sCLT1-dL (Gd-DOTA) 4 avec différentes concentrations à 60 MHz (1,5 T) avec un relaxometer à 37 ° C. Utilisez une séquence d'impulsions inversion-récupération de mesurer T 1 et une séquence Carr-Purcell-Meiboom-Gill avec 500 échos pour mesurer T 2. Calculer T 1 et T 2 relaxivités de eagents e des pentes des parcelles de 1 / T 1 et 1 / T 2 par rapport aux concentrations de Gd.

3. Culture cellulaire et le développement de modèle animal avec Orthotopique PC3 tumeur de la prostate

  1. Des cellules de cancer de la prostate Culture PC3 avec une expression constitutive de la protéine de fluorescence verte (GFP) dans du milieu RPMI supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal et de pénicilline / streptomycine / fungizone, récolte par traitement à la trypsine et remettre en suspension à une densité de 2,5 x 10 4 cellules / ul de PBS.
  2. Maintenir NIH souris nude athymiques hommes (âgés de 4-5 semaines) à l'installation athymique animale de base, Case Western Reserve University (CWRU) selon un protocole animale approuvé par le comité de protection et d'utilisation des animaux CWRU.
  3. Les surfaces chirurgicales ont été pulvérisées avec une solution de chlorhexidine à 2% et ensuite recouverts avec des rideaux absorbants. Gants chirurgicaux stériles ont été portés au cours de la procédure. Avant la chirurgie des animaux, ip injecter Avertin (250 mg / kg) à anesthetize les souris. En variante, la kétamine / xylazine / acépromazine peut être utilisé à une concentration de 50/5/1 mg / kg. Pommade ophtalmique a été appliquée à la souris pour maintenir une humidité suffisante au cours de l'anesthésie.
  4. Démarrer l'opération de coupe par une petite incision à travers la peau et du péritoine le long de la ligne médiane inférieure à une longueur d'environ 1 cm en utilisant un scalpel stérile. Un drap chirurgical stérile a été couvert autour du site d'incision lors d'interventions chirurgicales de survie.
  5. Extérioriser doucement et stabiliser les lobes dorsaux de la prostate pour exposer la prostate. Injecter la suspension de cellules PC3-GFP dans du PBS (20 ul) dans la prostate avec une aiguille de calibre 30. Enfin fermer l'incision avec la blessure autoclip 12.
  6. Pour la surveillance post-procédure, de surveiller les animaux deux fois par jour pendant 1 semaine. Les signes de la maladie sont le manque de manger, urine foncée collecte autour de l'urètre, et une démarche instable qui pourrait indiquer une infection ou à une occlusion de la vessie chez les agrafes.
  7. Après 10 jours, retirez til l'aide d'agrafes d'une agrafe remover. Surveiller les animaux tous les jours pour évaluer la taille de la tumeur et des preuves de la douleur comme la perte de poids, troubles du comportement, et des troubles moteurs. Euthanasier les animaux qui présentaient une taille de la tumeur ou de dépassement de la limite autorisée preuve éthique de la douleur au cours de la croissance tumorale.

4. Confirmation de la tumeur spécificité de liaison des peptides avec l'imagerie de fluorescence et histologie

  1. Après l'inoculation des cellules tumorales, permettre à environ 4 semaines de croissance de la tumeur avant de commencer avec la formation d'image. Avant l'injection des sondes peptidiques, acquérir des images de fluorescence de la GFP avec des souris vivantes sur un imageur de fluorescence pour vérifier la présence d'une tumeur.
  2. Iv injecter peptides marqués Texas Red à la tumeur chez des souris porteuses à une dose de 10 nmol / souris.
  3. Sacrifier la souris 2 heures plus tard par dislocation cervicale, de recueillir la tumeur et les organes principaux, et immédiatement l'image sur un imageur de fluorescence. Utilisez des filtres de lumière verte pour la GFP (excitation: 444-490 nm; émission: 515 nm filtre passe-haut; paramètres d'acquisition: de 500 à 720 en 10 étapes nm) et des filtres de lumière rouge pour le rouge Texas (excitation: 576 à 621 nm; émission: 635 nm filtre passe-haut, l'acquisition paramètres: 630-800 en 10 étapes nm). 10 ms temps d'exposition pour la GFP et 150 ms pour le rouge Texas.
  4. Immédiatement après la mesure de la fluorescence de tissus ensemble, collecter des tissus tumoraux, fixer avec du formol, et cryosection en tranches de 5 um.
  5. Après rinçage avec du PBS, monter avec 1 goutte de milieu de montage contenant 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), immédiatement l'image sur un microscope confocal à balayage laser microscope.

5. Imagerie par résonance magnétique (IRM),

  1. Environ 4 semaines après l'inoculation des cellules tumorales, permettent les tumeurs grandissent à 0,3-0,6 cm de diamètre. Utiliser un scanner IRM 7 T avec une fréquence radio de volume (RF) de bobines pour l'IRM.
  2. Anesthésier les souris avec un mélange d'isoflurane et d'oxygène de 2% dans une chambre d'induction de l'isoflurane. Ophthalmic pommade a été appliquée à la souris pour maintenir une humidité suffisante au cours de l'anesthésie.
  3. Insérer une aiguille de calibre 30 dans un long tube de 1,0 m rempli de sérum physiologique hépariné. Placer le cathéter de self-made dans la queue de la souris veine.
  4. Placez la souris sur l'aimant et garder sous anesthésie par inhalation avec 1,5% d'isoflurane en oxygène via un cône de nez.
  5. Placez un capteur respiratoire relié à un système de surveillance sur l'abdomen pour surveiller le rythme et la profondeur de la respiration. Maintenir la température du corps à 37 ° C en soufflant de l'air chaud dans l'aimant grâce à un système de commande à rétroaction.
  6. Commencez avec des images de coupe sagittale en utilisant une séquence de localisation pour identifier l'emplacement de la tumeur (TR / TE = 200/3.7 de ms, FOV = 3,0 cm, épaisseur de coupe = 2,2 mm, le nombre de tranche = 16, moyenne = 2, l'angle de bascule = 45 °, matrice = 128 x 128).
  7. Utilisez une séquence de suppression des données 2D T1 gradient graisse d'acquérir des images axiales 2D pour une IRM (TR / TE = 151.2/1.9 ms, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, sépaisseur de poux = 1,2 mm, le nombre de tranche = 12, moyenne = 1, l'angle de bascule = 80 °, matrice = 128 x 128).
  8. Après une pré-injection image MR référence acquisition, commencer à injecter l'agent ciblé ou de l'agent de contrôle à une dose de 0,03 mmol Gd / kg par rinçage avec 200 ul de solution saline.
  9. Continuer d'acquérir des images CE-IRM à différents points dans le temps pour un maximum de 30 minutes.

6. Traitement et analyse d'images

  1. Utiliser un logiciel de formation d'image pour l'analyse d'image.
  2. Attirer les régions d'intérêt (ROI) sur l'ensemble de la tumeur et les reins dans le plan d'imagerie en deux dimensions et à mesurer l'intensité de signal moyenne.
  3. Pour quantifier les données CE-IRM, de mesurer la tumeur ou des reins amélioration du contraste (ΔSNR) par le calcul de l'augmentation de la post-contraste SNR sur pré-contraste SNR selon l'équation suivante: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), où S 0 et S t représentent le signal dans la tumou les reins ou avant et après contraste, et σ 0 et σ t sont l'écart-type de bruit mesuré à partir de l'air ambiant avant et après contraste.
  4. Calculer les valeurs de p à l'aide de deux test t bilatéral de l'étudiant, en supposant que la signification statistique à p <0,05.

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Résultats

La figure 1 illustre la synthèse de l'agent de contraste ciblées CLT1-dL (Gd-DOTA) 4 et le schéma global de l'expérience. CLT1-dL (Gd-DOTA) 4 spectacles de relaxation beaucoup plus élevé que clinique Gd-DOTA (tableau 1). À 1,5 T, T 1 de relaxation par le gadolinium de CLT1-dL (Gd-DOTA) 4 dans du PBS (pH 7,4) est environ 3 fois plus élevée que celle de Gd-DOTA 10. imagerie de Maestro confirme la forte liaison spécifique de Texas Red marqué CL...

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Discussion

Étapes critiques

Sélection de biomarqueurs appropriés et ciblage petit peptide

Pour développer avec succès un agent de contraste ciblées avec une petite taille, deux points essentiels doivent être pris en considération. Tout d'abord, il est important de sélectionner des biomarqueurs moléculaires appropriés qui sont présents en abondance dans les tissus malades, où la présence dans les tissus normaux. Notre biomarqueur lié au cancer sélectionné, ...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail est soutenu en partie par l'American Heart Association GRA printemps 09 postdoctorale (09POST2250268) et le NIH R01 CA097465. Nous apprécions hautement le Dr Wen Li et le Dr Vikas Gulani pour le test de protocole IRM et la configuration, et Mme Yvonne Parker pour son aide lors de l'implantation de la tumeur.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
REAGENTS
Fmoc protectedamino acids EMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu)TCI America
PyBOP, HOBt, HBTUNova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacétate, TISSigma-Aldrich Corp.
Texas Red, ester succinimidylique, isomère uniqueInvitrogenT20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 Système HPLCAgilent
ZORBAX 300SB-C18 Colonne PrepHTAgilent
ICP-– ; S Optima 3100XLPerkin-Elmer
MALDI-TOF spectromètre de masseBrukerAutoflexTM Speed
Maestro FLEX Système d’imagerie in vivoCambridge Research Instrumentation, Inc.
Scanner IRM Biospec 7TBruker

Références

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