Article de méthode

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

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DOI :

10.3791/50568

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21 août 2013

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1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

Dans cet article

Résumé

L'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d'PJ-34.

Résumé

Dérivés de phénanthrène agissant comme inhibiteurs puissants PARP1 empêché le regroupement bi-focal de centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses humaines multi-centrosomales en mitose. Le phénanthridiniques PJ-34 est la molécule la plus puissante. Declustering d'extra-centrosomes provoque l'échec de la mitose et la mort cellulaire dans les cellules multi-centrosomales. Cancers humains les plus solides ont une forte présence des extra-centrosomes. L'activité de PJ-34 a été documentée en temps réel par imagerie confocale de cancer du sein humain vivant des cellules MDA-MB-231 transfectées avec des vecteurs codant pour fluorescent γ-tubuline, ce qui est très abondant dans les centrosomes et fluorescent histone H2B présent dans les chromosomes. Arrangements de chromosomes aberrants et de cluster-foyers γ-tubuline représentant centrosomes declustered ont été détectés dans les cellules transfectées MDA-MB-231 après le traitement avec PJ-34. Un-cluster-centrosomes supplémentaire dans les deux pôles du fuseau précédé leur mort cellulaire. Ces résultats liés for la première fois l'activité cytotoxique exclusive récemment détecté de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines avec des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose, et l'échec de la mitose conduisant à la mort cellulaire. Selon les résultats précédents observés par imagerie confocale de cellules fixes, PJ-34 cellules cancéreuses exclusivement éradiqué avec Multi-centrosomes sans altérer les cellules normales en mitose avec deux centrosomes et les broches bi-focal. Cette activité cytotoxique de PJ-34 n'a pas été partagée par d'autres PARP1 inhibiteurs puissants, et a été observée dans PARP1 déficientes MEF extracentrosomes hébergeant, suggérant son indépendance de PARP1 inhibition. Vivez l'imagerie confocale offre un outil utile pour identifier de nouvelles molécules éradiquer les cellules en mitose.

Introduction

Phénanthrène dérivé PARP1 inhibiteurs, y compris PJ-34, ont été conçus pour protéger les cellules au repos de la mort cellulaire par apoptose induite par le consommateur d'énergie PARP1 médiation réparation de l'ADN dans des conditions de stress (accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) 1. Toutefois, récemment, nous avons découvert que PJ-34, à une concentration deux fois plus élevée que celle induisant PARP1 inhibition, peut exclusivement provoquer la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines 2,3. Le plus rapide de la prolifération de la cellule était, le plus efficace à l'éradication des cellules était. L'activité cytotoxique de PJ-34 a été attribuée à des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose 2. Beaucoup humain cellules cancéreuses port multicentrosomes 4,5. L'incubation des cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231, qui abritent centrosomes surnuméraires, avec 20 uM PJ-34 éradiquée efficacement ces cellules au sein de 72-96 heures sans altérer les cellules au repos ou certaines cellules proliférantes bénignes abriter deux centrosomes dans la mitose 2,3. Cellules bénignes inclus cellules épithéliales mammaires humaines MCF-10, les cellules endothéliales humaines (HUVEC) et des cellules mésenchymateuses primaires préparées à partir de thymus humain. Ces cellules étaient résistantes à l'activité cytotoxique de PJ-34. PJ-34 n'interfère pas avec leur cycle cellulaire pendant 96 heures d'incubation ou d'affecter leur centrosomes et la formation du fuseau bi-focale 2,3.

Assemblée centrosome bipolaire est cruciale pour la formation du fuseau bipolaire dans la mitose 4,5. Par conséquent, les cellules avec plus de deux centrosomes ont mis au point un mécanisme moléculaire à peine compris, le regroupement de leurs centrosomes supplémentaires à deux pôles 4-9. Le défaut de montage bipolaire de leurs centrosomes peut causer multipolaire déformée broches et aberrant chromosomes ségrégation qui arrête le cycle cellulaire en G2 / M arrestation et conduit à la mort cellulaire attribuées à l'échec de la mitose 4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à des extra-centrosomes de-clusters sont intensivement étudiées 10. La compréhension de ce mécanisme de mort permettra l'éradication exclusive des cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains 5,10.

Ainsi, les composés qui activent la mort des cellules catastrophe mitotique offrent un nouveau mode de traitement du cancer sélectif, qui peut être efficace dans un large éventail de résultats de cancers.Our solides humaines suggèrent que l'imagerie confocale peut être utilisé pour identifier les molécules qui affectent extra-centrosomes regroupement en mitose 2,3, ce qui rend ces composés ciblant le cancer des candidats-médicaments.

Nous avons documenté l'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 par les cellules cancéreuses humaines fixe et direct (avec une forte présence d'extra-centrosomes dans la mitose) par rapport aux cellules normales de numérisation. Une étape par étape description des procédures d'imagerie utilisées pour identifier l'activité cytotoxique de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines est inclus ci-dessous.

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Protocole

1. Culture cellulaire Préparation

Cellules MDA-MB-231 ont été achetés auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection) et stockés dans de l'azote liquide.

  1. Seed 10 6 cellules MDA-MB-231 cellules dans 92 mm de diamètre boîte de Pétri dans 10 ml de milieu complet contenant Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% de sérum de cheval, 1% de L-glutamine et 1% Penstrep-Amphotéricine B. Laisser les cellules à proliférer à environ 80-100% de confluence.
  2. Retirer milieu de culture de plat et le jeter.
  3. Laver la couche de cellules brièvement avec 0,25% (p / v) solution de trypsine-EDTA pour éliminer toute trace de sérum.
  4. Ajouter 2,0 ml de solution de trypsine-EDTA à plat et d'observer les cellules au microscope inversé jusqu'à ce que la couche de cellules est dispersée (généralement dans les 5 à 15 min).
  5. Ajouter milieu de croissance complet de 18 ml et aspirer doucement les cellules de la pipette. Transférer dans un tube.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 1200 tours par minute.
  7. Re-suspendre le culot cellulaire dans 24 ml de cuLTURE moyenne.
  8. Ajouter 2 ml de suspension cellulaire à 35 plats à fond de verre mm (environ 25% de confluence) et placer dans un incubateur (5% de CO 2, 37 ° C).
  9. Solutions:
    1. Milieu complet pour la prolifération des cellules: DMEM avec 10% de FBS, 1% d'antibiotiques (100 unités / ml de pénicilline G, 100 pg / ml de streptomycine, la solution Pen-Strep-Ampho) et 2 mM de L-glutamine.
    2. Solution de trypsine-EDTA, contenant 0,25% de trypsine-EDTA.
  10. Plats:
    92 boîtes de Pétri mm de diamètre.
    35 mm de diamètre plats poly-D-lysine verre enduit culture fond.

2. Préparation des cellules pour l'imagerie confocale en direct

  1. Seed 2 x 10 5 cellules MDA-MB-231 cellules dans des boîtes de culture à fond de verre dans 2 ml de milieu complet tel que mentionné dans la section 1. Quand la culture cellulaire arrive à confluence de 60-70% (environ 10 5 cellules 3-4 x par boîte), procéder à la transfection.
  2. Transfection des cellules avec deux plasmides ENCODtion des protéines sur la fusion γ-tubuline-GFP (pour la détection fluorescente de centrosomes) et Histone-RED (H2b-RED, pour la détection par fluorescence des chromosomes) en utilisant le réactif de transfection liposomale Jet-PI, en suivant le protocole de fabrication. En bref, mélanger 2 pg de chaque plasmide dans un tube avec 100 pi de NaCl (150 mM). Mélanger le réactif de transfection (100 pi) avec 100 pi de NaCl (150 mM) dans un second tube et incuber 5 min à température ambiante (RT). Puis combiner les deux solutions, mélange (en utilisant vortex doux) et de spin-down. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
  3. Au cours de l'incubation du mélange de transfection, laver les cellules une fois avec du PBS et remplacer le milieu cellulaire avec 2 ml de DMEM chaud avec aucun supplément (37 ° C).
  4. Incorporer délicatement le mélange de transfection des cellules dans DMEM puis retourner les cellules de l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 8 heures.
  5. Après 8 heures d'incubation, remplacer le DMEM avec 2 ml de milieu complet et incuber les cellules dans l'incubateur pendant 24hr.
  6. 24 heures après transfection, remplacer le milieu des cellules avec 2 ml de milieu complet contenant 20 uM PJ-34.
  7. Incuber les cellules pendant plus de 18 heures (37 ° C, 5% de CO 2).
  8. Sujet les cellules à vivre imagerie confocale pendant au moins 16 heures dans la chambre d'imagerie maintenir les cellules à 5% de CO 2 et 37 ° C.
  9. En parallèle, d'examiner l'efficacité de transfection 36 h après la transfection en utilisant la microscopie à fluorescence comme suit:
    1. Seed 2 x 10 5 cellules MDA-MB-231 cellules dans la plaque de 6 puits contenant 1 lamelle par puits dans 2 ml de milieu complet.
    2. Transfection des cellules comme mentionné dans les sections 2.2 à 2.5.
    3. 36 h après la transfection fixer les cellules transfectées montés sur une lamelle en incubation dans du méthanol froid: acétone (1:1) solution, 7 min, -20 ° C.
    4. Aspirer la solution de fixation et de laisser la lamelle avec les cellules montées à sec dans une hotte chimique.
    5. Appliquer ProLong réactif antifade d'or avec DAPI et laisser èmee lamelle de sécher dans l'obscurité pendant 6 heures.
    6. Examiner la lame sous microscope à fluorescence et de calculer le pourcentage de cellules transfectées (signaux rouge et vert) de la population totale de cellules (coloration de l'ADN par DAPI). Le pourcentage de transfection souhaitée est d'environ 20-40% lorsque les cellules sont comptées 100-200.

3. Paramètres techniques des confocale Paramètres du scanner d'imagerie en direct

  1. Scanmode XYZT; sténopé [aéré] 1,00; Zoom 3.5, résolution 8 bits; Laser DPSS 561 nm; l'argon, laser visible 488 nm; laser He / Ne visibles 633 nm; Objectif HCX PL APO CS 63X 1,40 HUILE UV; Ouverture numérique 1.4; Vitesse de numérisation 700 Hz, l'indice de réfraction de 1,52.
  2. Présentation de l'image 3-D ont été préparés par Imaris logiciel d'imagerie 7.0.

4. Imagerie confocale de la mitose dans les cellules fixées

  1. Seed 2 x 10 5 cellules MDA-MB-231 cellules mammaires cancéreuses (ATCC), les fibroblastes embryonnaires de souris normales (MEF), ou PARP1 déficient MEF (PARP - / -, préparé par le Dr Françoise Dantzer) sur des lamelles de verre en plaque de 6 puits dans 2 ml de milieu complet. Lamelles ont été lavées avec de l'éthanol à 96%, à la suite d'un lavage avec de l'eau stérile DD, séché pendant 2 heures, et placé dans chaque puits de plat à 6 puits.
  2. Ajouter PJ-34 (10-30 uM) au milieu et incuber les cellules pendant la période requise (habituellement jusqu'à 96 h).
  3. Laver les lamelles fois avec du PBS (tampon phosphate salin), et fixer les cellules à l'aide incubation dans du méthanol glacé: solution d'acétone (1:1), 7 min, -20 ° C.
  4. Aspirer la solution de fixation et de laisser les lamelles de sécher dans la hotte chimique (à ce stade, les lamelles peuvent être conservés dans -20 ° C pendant plusieurs semaines).
  5. Laver les lamelles fois avec PBST (PBS additionné de 0,1% de Tween-20) pour perméabiliser les membranes cellulaires et bloquer les cellules avec 10% NDS (Normal Sérum d'Ane) en PBS («solution de blocage») pendant 1 heure à température ambiante.
  6. Incuber les cellules fixes perméabilisées avec Antibodi primairees pendant 2 heures à température ambiante (pour les broches et centrosomes coloration). Les anticorps sont dilués dans la solution de blocage comme suit: anti-tubuline α (1:250 dilution) et anti-tubuline γ (dilution 1:200). Les anticorps primaires sont appliqués comme suit: appliquer 100 pl (dans une goutte) d'un mélange d'anticorps dans la solution de blocage pour chaque lamelle couvre-objet sur le couvercle de la plaque à 6 puits (le couvercle est à l'envers). Mettre doucement la lamelle sur la goutte d'anticorps, les cellules ensemencées face à la baisse. Incuber les lamelles auxquels sont confrontés les anticorps pendant 2 h à température ambiante.
  7. Placez les lamelles de retour dans les puits et laver les cellules 3 fois avec PBST. Ensuite, utilisez la même procédure décrite à l'article 4.6 pour le marquage de cellules sur les lamelles avec les anticorps secondaires fluorescents. Incuber les cellules sur les lamelles avec les anticorps secondaires pour 1 h, RT, dans l'obscurité. Les anticorps sont dilués dans la solution de blocage comme suit: Alexa Fluor 488 (1:1000 dilution; vert) et Alexa Fluor 568 (1:1000 dilution;rouge).
  8. Monter les lamelles à l'aide de prolonger réactif antifade or avec DAPI (pour la coloration des chromosomes) et incuber une nuit à température ambiante dans l'obscurité à sécher.
  9. Examiner les lamelles par microscopie confocale.

5. viabilité cellulaire mesurée par la production d'ATP

La production d'ATP est mesurée par un kit de dosage de détection d'ATP luminescent.

  1. Seed les cellules en plaque de 96 puits, environ 20.000 cellules dans 800 pi de milieu dans chaque puits. Trois puits vierges devraient être utilisés pour la détermination de la luminescence de fond du milieu.
  2. Préparer ATP série de dilution standard d'environ 10 et 100 micromètres et garder sur la glace.
  3. Ajouter 50 l de détergent dans chaque puits et agiter la plaque pendant 5 min dans un agitateur orbital, à 700 rpm.
  4. Reconstituer chaque flacon du «substrat lyophilisé» avec 5 ml de «tampon de substrat» dans le kit.
  5. Ajouter 50 ul de la solution de substrat reconstitué dans les puits, et secouezla plaque pendant 5 min sur agitateur orbital, à 700 rpm.
  6. Conservez la plaque dans l'obscurité pendant 10 min.
  7. Mesurer luminescence de chaque puits par ELISA lecteur de microplaques.

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Résultats

PJ-34 est un stable soluble dans l'eau phénanthridiniques 1 (figure 1). Nos résultats précédents ont révélé la mort cellulaire et de-regroupés extra-centrosomes dans plusieurs types de cellules cancéreuses multi-centrosomales fixes qui ont été traités avec PJ-34. En revanche, les cellules proliférantes normales n'ont pas été altérées 2,3. Centrosomes ont été identifiés par un double marquage avec des anticorps dirigés contre centrine1 et γ-tubuline dans les cellules extra-c...

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Discussion

Vivez l'imagerie confocale a fourni une documentation en temps réel de l'effet cytotoxique de PJ-34 dans les cellules multi-centrosomales en direct pendant la mitose (Figure 3 et les informations supplémentaires). Ce fut la première documentation en direct attribuant la cytotoxicité de PJ-34 dans les cellules humaines de cancer de centrosomes supplémentaires de-regroupement et la mort cellulaire, suggérant l'induction de la mort cellulaire de la catastrophe mitotique par PJ-34 5-9.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Les sources de financement de cette recherche: un fonds commun de la société de l'Université de Tel Aviv de transfert technologique, Ramot et le Centre Sheba-Medical (M. CA et SI)., ICRF - Fondation de la recherche sur le cancer israélien (M. CA.) Et la Fondation israélienne des sciences ( SI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
REAGENTS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965  ;
FBS (Sérum de veau fœtal)Invitrogen (GIBCO)12657  ;
Solution Pen-Strep-AmphoBiological Industries, Israël03-033-1B  ;
L-glutamineinvitrogène (GIBCO)25030-024  ;
0,25 % Tripsin-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200²
Boîtes de Pétri 92 mmNunc,Thermo scientific150350  ;
Boîtes de culture à fond en verre revêtu de poly-D-lysine de 35 mmMatTek Corporation, USAP35GC-0-14-C  ;
Kit de dosage de détection ATP luminescenteAbcamab113849  ;
NDS (Sérum d’âne normal)Jackson ImmunoResearch017-000-121  ;
Anticorps anti-alpha-tubulineSigmaT9026dilution 1:250 (IF)
Anticorps anti-&gamma ;-tubulineSigmaT5192dilution 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-11017dilution 1:1 000 (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-RabbitIgG InvitrogenA-10042dilution 1:1 000 (IF)
Réactif anti-décoloration ProLong Gold avec DAPI (montage)InvitrogenP36935  ;
JetPEI (réactif de transfection liposomale)Polyplus101-10  ;
/fort>
Microscope confocalLeica (Mannheim, Allemagne)TCS SP5II  ;

Références

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Mots-clés

PJ 34D groupement des centrosomesImagerie confocale sur cellules vivanteschec mitotiqueMort des cellules canc reusesGamma tubulineHistone H2bCellules multicentrosomalesInhibition de PARP1MDA MB 231

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