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Article de méthode

La transplantation de cellules olfactives engainantes à évaluer la récupération fonctionnelle après des nerfs périphériques blessures

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DOI :

10.3791/50590

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23 février 2014

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1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

Dans cet article

Résumé

Cellules olfactives engainantes (OECO) sont des cellules de la crête neurale qui permettent la croissance des neurones olfactifs primaires. Cette propriété spécifique peut être utilisé pour la transplantation cellulaire. Nous présentons ici un modèle de transplantation cellulaire basé sur l'utilisation de la COE dans un modèle de lésion du nerf laryngé.

Résumé

Cellules olfactives engainantes (OECO) sont des cellules de la crête neurale qui permettent la croissance et la repousse des neurones olfactifs primaires. En effet, le système olfactif principal est caractérisée par son aptitude à donner naissance à de nouveaux neurones, même chez les animaux adultes. Cette aptitude particulière est due en partie à la présence de OECs qui crée un micro-environnement favorable pour la neurogenèse. Cette propriété de COE a été utilisé pour la transplantation cellulaire comme dans les modèles de lésion de la moelle épinière. Bien que le système nerveux périphérique a une plus grande capacité à se régénérer après une lésion nerveuse que le système nerveux central, des sections complètes induire misrouting pendant repousse axonale en particulier après le visage de la section du nerf laryngé. Plus précisément, plein sectionnement du nerf laryngé récurrent (NLR) induit repousse axonale aberrante résultant en syncinésie des cordes vocales. Dans ce modèle spécifique, nous avons montré que la transplantation COE augmente efficacement axonale repousse. ve_content "> OEC sont constituées de plusieurs sous-populations présentes à la fois dans la muqueuse olfactive (OM-OEC) et les bulbes olfactifs (OB-OECO). Nous présentons ici un modèle de transplantation cellulaire basé sur l'utilisation de ces différentes sous-populations de COE dans un modèle de lésion du NLR. L'utilisation de ce paradigme, des cultures primaires de OB-OEC et OM-OEC ont été transplantés dans Matrigel après l'article et l'anastomose du nerf récurrent. Deux mois après la chirurgie, nous avons évalué les animaux transplantés par des analyses complémentaires sur la base de videolaryngoscopy, électromyographie (EMG) , et des études histologiques. d'abord, videolaryngoscopy nous a permis d'évaluer les fonctions du larynx, en particulier des co-contractions musculaires phénomènes. Ensuite, EMG analyse richesse démontrée et la synchronisation des activités musculaires. Enfin, des études histologiques sur la base de toluidine coloration au bleu de permis de quantifier le nombre et le profil des fibres myélinisées.

Tous ensemble, nous décrivons ici comment isoler, de la culture, identifier et transplantation OEC de l'OM et OB après NLR section-anastomose et la façon d'évaluer et d'analyser l'efficacité de ces cellules transplantées sur les fonctions de repousse axonale et du larynx.

Introduction

Le système olfactif principal est composé de deux parties distinctes, la muqueuse olfactive (OM) dans le système nerveux périphérique et le bulbe olfactif (OB) dans le système nerveux central. Le système olfactif primaire est caractérisée par la capacité des neurones olfactifs primaires (PON) afin de s'auto-renouveler tout au long de la vie chez les espèces de mammifères. Cette capacité est rendue possible en raison de la présence de cellules souches neurales dans l'OM. Croissance PON et la repousse de l'OM à OB est facilitée par les cellules gliales spécialisées appelées cellules olfactives engainantes (OECO). OEC sont des cellules de la crête neurale qui créent un micro-environnement favorable pour la neurogenèse du PON de l'OM à OB 1. Ainsi, OEC peut être trouvée dans l'OM et dans l'OB constituant différentes sous-populations de cellules 2,3. Les différentes propriétés de l'OECO ont principaux scientifiques de les utiliser pour des transplantations cellulaires dans plusieurs paradigmes de lésions du système nerveux 4. En effet, l'OECO facteurs de croissance des produits, de réduire les effrayer gliale, prrepousse axonale omote, et peut librement mêler aux astrocytes 5,6. Cependant, la grande majorité de ces études sont basées sur les lésions de la moelle épinière (SCI); quelques-uns d'entre eux ont utilisé OEC après une lésion nerveuse périphérique (PNI) 7,8.

Bien que le système nerveux périphérique a une grande capacité à se régénérer après une lésion nerveuse, remplissez les sections induire aberrante axonale repousse. En effet, après transections complets du visage ou les nerfs récurrents (NLR) des axones mal acheminées provoquent des co-contractions musculaires appelées syncinésie. Par conséquent, il est primordial de proposer un modèle de PNI pour quantifier non seulement repousse axonale, mais aussi d'évaluer l'efficacité des contractions musculaires. Dans la littérature le modèle le plus commun décrit est basé sur une lésion du nerf facial 9,10. Dans ce modèle, les évaluations fonctionnelles sont basés sur la récupération des mouvements moustaches 10. Il est cependant compliqué à démontrer l'efficacité de la movNTS et de discriminer les co-contractions musculaires phénomènes. Nous vous proposons ici un modèle basé sur une lésion du NLR. Ce modèle permet l'évaluation de la repousse et non seulement les mouvements des cordes vocales axonale mais également l'efficacité et la fonctionnalité de ces mouvements après des transplantations cellulaires 11,12. Ce protocole prévoit une procédure étape par étape à la culture et à la transplantation OEC de l'OM et OB dans un modèle de section NLR / anastomose et à évaluer les animaux après la chirurgie.

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Protocole

Une. Des cultures primaires de la muqueuse olfactive et olfactive Ampoules

  1. Avant la dissection
    1. Faire milieu, pour 50 ml, en ajoutant 44 ml d'sans calcium Dulbecco Modified Eagle / F12 de milieu de Ham (DMEM/F12) additionné de 5 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 ml de pénicilline / streptomycine.
    2. Manteau de flacons de 75 cm2 avec du poly-L-lysine (50 ng / ml, 1,5 ug / cm 2), 1 heure à température ambiante.
    3. Rincer les flacons avec du PBS 1x.
    4. Conserver les flacons enrobés dans le réfrigérateur jusqu'à 1 semaine.
  2. Dissection
    1. Toute méthode d'euthanasie doit être approuvée à l'avance par les soins des animaux et l'utilisation du comité de l'institution et réalisée par un personnel qualifié.
    2. Choisissez rats consanguins comme les rats Fischer.
    3. Après le rat a été confirmé avoir conclu une anesthésie profonde avec du pentobarbital de sodium ou d'autres formes injectables de l'anesthésie comme la kétamine / xylazine, décapiter lui et rEDéplacez la peau.
    4. Ouvrir la boîte crânienne de la partie antérieure à la partie postérieure.
    5. Retirez la prise de OB soin d'éviter les méninges.
    6. Dans le même rat, ouvrir la cavité nasale sagittaly.
    7. Supprimer le OM prenant soin d'éviter la muqueuse respiratoire. Notez que l'épithélium OM peut être facilement identifié par sa couleur jaunâtre.
    8. Protocoles plus détaillés sur la dissection de l'OM peuvent être trouver dans une précédente J. Vis. Exp . publication 13.
  3. Culture
    1. Placer OB en sel tamponné la solution de Hank (HBSS) contenant 0,1% de trypsine pendant 45 min à 37 ° C.
    2. Placer OM dans du HBSS contenant 0,05% de collagénase A pendant 45 min à 37 ° C.
    3. Arrêtez digestion enzymatique par addition de 2 ml de milieu chaud.
    4. Laver les cellules avec le milieu et les centrifuger à 300 g pendant 3 min.
    5. Échantillons de triturer 2ml de milieu à l'aide d'une pipette P1000 jusqu'à une suspension cellulaire homogène.
    6. Plaquer les cellules dans les flacons pré-revêtues (5-10 x 10 6 cellules / flacon) avec 25 ml de milieu chaud.
    7. Incuber les cellules et à la culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    8. Changer la moitié du milieu tous les 2 jours.
    9. Après 6-8 jours in vitro, consultez la proportion de cellules p75 positifs sur de petits échantillons de cellules, supposé être OEC chez les rongeurs, par cytométrie de flux ou par immunocytochimie. Pour ces analyses, d'autres marqueurs peuvent être étudiés tels que la GFAP et S100β.
  4. La cytométrie en flux analyse
    1. Recueillir les cellules comme décrit dans (section 2.2 ci-dessous) "transplantation cellulaire".
    2. Les incuber avec l'anticorps primaire p75 (1:100) pendant 15 min à 4 ° C.
    3. Laver les cellules avec 2 ml de PBS-EDTA et les centrifuger à 300 g pendant 3 min.
    4. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire conjugué à PE anti-souris pendant 15min à 4 ° C dans l'obscurité (1:200).
    5. Laver les cellules avec 2 ml de PBS-EDTA et les centrifuger à 300 g pendant 3 min.
    6. Remettre en suspension les cellules dans 500 ul de PBS-EDTA.
    7. Analyser 10-30 x 10 3 cellules avec cytomètre en flux.
  5. analyse de Immunocytochemistry
    1. Plaquer les cellules dans des plaques 6 puits prérevêtues pendant 48 heures comme décrit dans (section 1.1.2 ci-dessous) «culture».
    2. Laver les cellules avec du PBS.
    3. Fixer les cellules avec PFA 4% pendant 15 min à température ambiante.
    4. Laver les cellules avec du PBS.
    5. Incuber les cellules avec du PBS / Triton X100 (0,1%) pendant 15 min à température ambiante.
    6. Laver les cellules avec du PBS.
    7. Incuber les cellules avec des anticorps primaires (1:200): p75, S100β GFAP et pendant une nuit à 4 ° C.
    8. Laver les cellules avec du PBS.
    9. Incuber les cellules avec les anticorps secondaires (1:500) pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité.
    10. Laver les cellules avec du PBS.
    11. Incuber les cellules avec Hoechst 10 min à RT dans l'obscurité.
    12. Laver les cellules avec du PBS.
    13. Analyser les cellules en utilisant un microscope à fluorescence.
  6. cellules d'étiquetage de la GFP
    1. Cinq jours avant la transplantation, infecter OB et OM cultures pendant la nuit avec un vecteur lentiviral hébergement GFP améliorée (de multiplicité d'infection: 20).
    2. Avant l'arrivée de la transplantation sur de petits échantillons du taux de cellules GFP-positives par cytométrie de flux comme décrit précédemment dans (section 1.1) "culture".

2. Chirurgie et Transplantation

  1. Nerf récurrent anastomose
    1. Toutes les expériences sur les animaux doivent être approuvées à l'avance par les soins des animaux et l'utilisation du comité de l'institution et effectuées par du personnel qualifié.
    2. Avant la chirurgie autoclave tous les instruments et maintenir la stérilité pendant les interventions chirurgicales.
    3. Anesthésier rat par injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (12,5 mg / kg) et du chlorhydrate de chlorpromazine (0,625 mg / kg). Évaluer l'adéquation de l'anesthésie par pincement de l'orteil avant la chirurgie.
    4. Placez le rat en décubitus dorsal.
    5. Effectuer une incision verticale moyenne de 2 cm du col cutanée avec un scalpel.
    6. Effectuer une incision verticale des muscles sous-hyoïdiens suivant la ligne blanche médiane.
    7. Exposer larynx à l'aide enrouleur autostatic entre les muscles sous-hyoïdiens.
    8. Exposer le nerf récurrent.
    9. Sous contrôle microscopique, couper le nerf pleinement avec microciseaux au niveau de l'anneau trachéal septième.
    10. Effectuer anastomose en utilisant un point de suture 11.0 sous contrôle microscopique. Cette opération conduit à une dénervation du moteur spécifique du larynx.
  2. Transplantation cellulaire
    1. Juste avant la transplantation, éliminer les cellules des plats à base de 0,05% de trypsine EDTA pendant 5 min à 37 ° C.
    2. Arrêtez digestion enzymatique par addition de 2 ml de milieu chaud.
    3. Centrifuger à 300 g pendant 3 min.
    4. Sous un microscope compter les cellules en utilisant un hématimètre et ajuster la concentration cellulaire selon le protocole spécifique. Dans ce modèle, les concentrations désirées sont entre 1,2 à 6 x 10 6 cellules dans 30 ul de DMEM/F12.
    5. Faire la préparation cellulaire avec 1:02 mélange (30 et 60 pi de cette expérience) de l DMEM/F12-Matrige en tube de 1,5 ml avant la greffe et le placer sur la glace. Pour éviter les effets non spécifiques, utilisez le facteur de croissance réduite Matrigel.
    6. Juste avant la transplantation maintenir le tube dans votre main pendant quelques secondes pour réchauffer le mélange Matrigel moyen.
    7. Déposer le mélange sur le site d'anastomose aide d'une pipette et attendre jusqu'à ce que le mélange s'auto-assemble sur le nerf lésé.
    8. Fermez les muscles et la peau avec une suture 4.0.
    9. Maison des rats individuellement et garder sous une lampe chauffante pendant 24 heures.

3. Évaluation

  1. Laryngoscopie
    1. Anesthésier les rats par intraperitoneal injection de chlorhydrate de kétamine (12,5 mg / kg) et du chlorhydrate de chlorpromazine (0,625 mg / kg). Confirmez rats sont anesthésiés avec une pincée de pieds avant de procéder avec le protocole.
    2. Placez le rat en décubitus dorsal.
    3. Insérez un 30 ° vidéolaryngoscope ajustés pour fournir la meilleure vue du larynx. Déterminer des repères anatomiques de reproduire le même point de vue pour chaque enregistrement.
    4. Enregistrer les mouvements des cordes vocales à l'aide du vidéolaryngoscope (5-10 séquences / animal). Pour chaque animal, sélectionner trois séquences d'adduction maximale successive et l'enlèvement maximal.
    5. Analyser la fonction du larynx en utilisant un logiciel d'analyse d'image. Déterminer le mouvement angulaire absolue en mesurant la différence entre le mouvement d'abduction et d'adduction maximale maximale des cordes vocales. Déterminer le score dynamique en mesurant l'amplitude du mouvement. Déterminer score fonctionnel en mesurant la syncinésie et mouvements paradoxaux.
  2. Électromyographie (EMG)
    1. Placez une électrode sur les muscles ischio-jambiers de la rat pour l'isolation électrique.
    2. Exposer larynx et la trachée en ouvrant la peau et les muscles comme décrit précédemment dans "nerf anastomose récurrente» (section 2.1).
    3. Exposer le cartilage cricothyroïdienne.
    4. Ouvrez le cartilage cricothyroïdienne pour exposer la cricoarytenoid postérieure (ACP) de muscles en utilisant microciseaux.
    5. Introduire une aiguille électrode monopolaire (38 x 0,45 mm) dans le muscle de l'APC.
    6. Enregistrer l'activité musculaire électrique du muscle PCA en utilisant un système d'acquisition lors de la ventilation spontanée.
    7. Analyser l'activité musculaire en termes de richesse et la synchronisation avec la respiration. Pour analyser EMG, attribuer une note qualitative de 0-3 selon l'échelle suivante: 0: traçage unrhymed, sans augmentation pendant l'inspiration, 1: traçage rimé avec inspiratoire augmenter, mais pauvre traçage (Neurogen), 2: rimée traçage avec une activité plus riche, 3: rimée traçage, très riche, constituant un imotif de nterférences noc, semblable à une activité intentionnelle maximale.
    8. Exposer le nerf vague pour mesurer la durée de latence et le potentiel. Le nerf vague est choisi comme site de stimulation car NLR peut être endommagé lors de la stimulation en raison de sa petite taille.
    9. Stimuler le nerf vague avec une électrode.
    10. Enregistrer des signaux électriques dans le muscle de l'APC. Mesurer la latence et la durée du potentiel. Si possible d'utiliser un module d'acquisition pour enregistrer l'activité musculaire, la latence et la durée du potentiel d'un tel système Powerlab.
  3. Histologie
    1. Euthanasier l'animal en utilisant une overdose de pentobarbital.
    2. Retirez le moignon distal du nerf récurrent sous contrôle microscopique. La partie distale du RLN est définie comme étant la partie entre anastomose et du larynx. A noter qu'il est possible de trouver sur le site d'anastomose plusieurs semaines après la chirurgie parce que la suture est une suture à 11,0 non résorbable.
    3. Placer la partie distale de RLN en glutaraldéhyde à 2% avec 0,1 M de phosphate(PH = 7,3) pendant 2 h à 4 ° C.
    4. Orienter soigneusement les échantillons pour réaliser des coupes coronales.
    5. Laver les échantillons dans un tampon phosphate.
    6. Couper en segments plus petits (3-4 mm de longueur) et le suffixe pendant 60 min à température ambiante dans 1% en tampon cacodylate OsO 4 et déshydraté avec de l'éthanol.
    7. Orienter les échantillons dans des moules silicones et incorporé dans les résines consistant en POLYBED 812, DDSA et MNA, auquel on a ajouté 2% de l'accélérateur BDMA.
    8. Faire sections transversales semi-fines (1 um d'épaisseur) en utilisant un système Ultramicrotomie Pyramitome.
    9. Colorer avec 0,1% de bleu de toluidine dans le tétraborate de sodium à 1% pour 75 sec à 70 ° C.
    10. Analyser les échantillons RLN avec un système d'analyse de comptage. Compter le nombre de fibres et de mesurer les profils des fibres nerveuses myélinisées par la détermination de la limite extérieure et intérieure de la gaine de myéline.
  4. Transplantation
    1. Préparer les cellules pour la transplantation et transplanter les cellules comme décrit précédemmentdans la «transplantation cellulaire" (section 2.2).
    2. Analyse
    3. Euthanasier l'animal en utilisant une overdose de pentobarbital. A noter que la fixation des animaux peut être réalisée en utilisant une injection intracardiaque de PFA à 4%.
    4. Retirez environ 2 cm de NLR. Utilisez parties proximale et distale du nerf récurrent.
    5. Fixer échantillon de NLR dans l'azote liquide.
    6. Conserver les échantillons à -80 ° C.
    7. Couper les échantillons à l'aide longitudinalement cryostat (10-20 um d'épaisseur).
    8. Analyser des échantillons sous microscope à fluorescence pour détecter les cellules GFP-positives. A noter que l'anticorps anti-GFP peut être utilisée pour augmenter l'émission de fluorescence et d'effectuer costainings.

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Résultats

Illustrations avec contrôle et (section / anastomosés) animaux réinnervé ont été choisis comme les résultats peuvent varier en fonction des transplantations cellulaires effectuées (OM, OB ou OM + OB).

La culture cellulaire
Les cellules adhèrent rapidement à la surface de matière plastique et sont devenus distincts en andains parallèles de cellules qui sont de forme allongée ou conique, triangulaire, multipolaire, ou en forme de fuseau (figures 1A et 1B)...

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Discussion

Les techniques présentées ici font OECs un modèle utile pour étudier les transplantations cellulaires dans les modèles de lésion nerveuse périphérique. Le protocole de culture de cellules est relativement simple et peut être facilement effectuée. D'autre part, les interventions chirurgicales, en particulier l'article / anastomose du nerf récurrent, exigent de l'expérience et doivent être effectuées par du personnel qualifié.

Les procédures décrites dans ce protocole mettent en év...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires) et la Fondation de l'Avenir pour leur soutien financier et à M. Fanie Barnabé-Heider pour éditer le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
Péniciline/streptomycineInvitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
Trypsin-EDTAInvitrogenM3513P
CacodylateMerck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE anti-souris  ;BD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
Collagenase ARoche10103586001
Souris anti P75ChemiconMAB 365
11.0 FilEthiconFG 2881
Bleu Toluidine  ;Ral Diagnostics361590-0025
CentrifugeuseSigmaSigma 2-16PK
Incubateur  ;Thermo Scientific
Hotte à flux laminaireFasterBH-EN 2003 S
Cytomètreen flux BD BioscienceFACSCalibur
MicroscopeZeiss
VideolaryngoscopeKarl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC 20212120
Système d’acquisitionAD InstrumentsPowerlab
Système d’ultramicrotomie au pyramitome  ;SystèmeUltracut S
Explora NovaMercator
d’analyse d’images Leica

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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