Nous décrivons une méthode pour effectuer l'analyse génétique dans Chlamydia basé sur la mutagenèse chimique et le séquençage complet du génome. En outre, un système d'échange de l'ADN dans les cellules infectées est décrite qui peut être utilisé pour la cartographie génétique. Cette méthode peut être largement applicable à des systèmes microbiens manquant des systèmes de transformation et des outils de génétique moléculaire.
Chlamydia trachomatis, l'agent étiologique des maladies sexuellement transmissibles et les infections oculaires, reste mal caractérisée par son indocilité à la transformation expérimentale avec de l'ADN recombinant. Nous avons développé une approche pour effectuer l'analyse génétique de C. trachomatis malgré l'absence d'outils de génétique moléculaire. Notre méthode consiste à: i) la mutagenèse chimique pour générer rapidement des bibliothèques complètes de mutants génétiquement définis avec des phénotypes distincts; ii) séquençage du génome entier (WGS) pour cartographier les lésions génétiques sous-jacents et de trouver des associations entre gène muté (s) et.. un phénotype commun;. iii) la production de souches recombinantes à travers la co-infection de cellules de mammifères par des bactéries de type mutant et sauvage. En conséquence, nous avons pu établir des relations causales entre les génotypes et les phénotypes. Le couplage de variation génique induite chimiquement et WGS de créer des associations génotype-phénotype corrélatives should être largement applicable à la grande liste des micro-organismes médicalement et écologiquement importantes actuellement insolubles à l'analyse génétique.
Les intracellulaire obligatoire bactérie Chlamydia comptes trachomatis pour environ 2,8 millions d'infections génitales des voies par an aux Etats-Unis (Center for Disease Control) avec associé séquelles telles que la maladie inflammatoire pelvienne, des grossesses ectopiques et l'infertilité (1). Chlamydia spp ont une occasion unique physiologie d'un cycle de développement biphasique consistant en deux formes: le corps élémentaire infectieux mais non répliquant (EB) et le corps réticulé non infectieux mais réplicatif (RB). L'infection commence par la fixation d'EBS aux cellules épithéliales suivies endoctyotosis (2). Au....
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1. Mutagenèse chimique
Note: Nous avons constaté que la forme de RB réplicative est plus propice à la mutagenèse chimique que le formulaire de EB. Au milieu de cycle (entre 18 à 20 HPI), RBS sont au plus grand nombre avant la transition RB-EB. Parce que Chlamydia trachomatis est un pathogène intracellulaire obligatoire, les effets de l'agent mutagène sur la santé de l'hôte peut limiter la récupération bactérienne. Des cellules Vero ont été trouvés à être plus résistantes aux effets néfastes des niveaux élevés de SME que d'autres lignées cellulaires testées.
Séparation des mutations par recom....
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L'exposition aux substances mutagènes conduit à inclusions qui semblent dépourvues de bactéries, probablement en raison de la mort de la cellule bactérienne. Typiquement, le sérotype LGV-L2 sera complètement lyse des cellules infectées dans les 48 heures après l'infection, mais le traitement avec mutagènes peut prolonger ce cycle> 90 h. Environ 10% des inclusions devraient se redresser. Dans nos expériences, les cellules Vero infectées traitées avec 20 mg / ml EMS a entraîné une diminution de 99% dans la récu.......
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Cette méthodologie répond aux exigences de base pour l'analyse génétique, car elle établit lien entre les génotypes et les phénotypes. Surtout, ce résultat est obtenu sans l'aide d'outils moléculaires classiques pour la transformation de l'ADN recombinant et inactivation par insertion de gènes dans des bactéries, ce qui est souvent une étape limitante dans l'analyse de la fonction des gènes dans les microbes non-modèles.
Une étape essentielle est d'assurer la clonalit.......
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Medium Eagle modifié (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Cellgro | 35-010-CV | |
| Méthanesulfonate d’éthyle (EMS) | Sigma | M0880 | |
| Cyclohexamide | Sigma | C4859-1ML | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Life Technologies | 14190-144 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,493 mM de MgCl2 et 0,901 mM de CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) | Life Technologies | 14040-133 | |
| 1 M NaOH | |||
| 5x tampon SPG (1,25 M de saccharose, 50 mM de phosphate de sodium, 25 mM d’acide glutamique) | |||
| Tampon SPG (0,25 M de saccharose, 10 mM de phosphate de sodium, 5 mM d’acide glutamique) | |||
| Eau (stérile, de qualité culture tissulaire) | |||
| 2x DMEM (préparé à partir de poudre, tamponné avec 7,4 g/L de bicarbonate de sodium | Sigma | D7777 | |
| Acides aminés non essentiels (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| 1,2 % GTG Agarose , autoclave | Lonzo | 50070 | |
| Kits de purification d’ADN génomique | Qiagen | 69504 | |
| DNAzol | Life Technologies | 10503-027 | |
| Éthanol (qualité biologie moléculaire) | |||
| 8 mM NaOH | |||
| 0,1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyéthyl)-1- tampon pipérazineéthanesulfonique) Flacons | |||
| culture tissulaire de 25 cm2 (flacons T25) | |||
| Plaques de culture tissulaire à 6 puits Plaques | |||
| de culture tissulaire à 12 puits | |||
| Plaques | |||
| Capot | |||
| chimique Biologique capot | |||
| >Centrifugeuse et adaptateurs pour la rotation des plaques | |||
| tissus>Microscope | |||
| Fluorimètre (Qubit) | Invitrogen | Q32866 | |
| Adaptive Focused Acoustics S220 instrument | Covaris |
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