Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Résumé

De nombreuses applications thérapeutiques nécessitent un transport sûr et efficace des transporteurs de drogue et leurs cargaisons à travers les barrières cellulaires dans le corps. Cet article décrit une adaptation des méthodes établies pour évaluer la vitesse et le mécanisme de transport de nanovecteurs de médicaments (NCS) à travers les barrières cellulaires, telles que la gastro-intestinale (GI) épithélium.

Résumé

Transporteurs sous-micrométriques (nanocarriers; CN) améliorer l'efficacité des médicaments en améliorant la solubilité, stabilité, temps de circulation, le ciblage et la libération. En outre, traversant les barrières cellulaires dans le corps est crucial à la fois pour l'administration orale de CN thérapeutiques dans la circulation et le transport du sang vers les tissus, où l'intervention est nécessaire. Le transport NC à travers les barrières cellulaires est obtenue par: (i) la voie paracellulaire, par l'intermédiaire de la perturbation transitoire des jonctions qui s'imbriquent les cellules adjacentes, ou (ii) la voie transcellulaire, où les matériaux sont internalisées par endocytose et transportées à travers le corps de la cellule et sécrétée à la surface de la cellule opposée (transyctosis). Livraison à travers les barrières cellulaires peut être facilitée en couplant la thérapeutique ou de leurs supports avec des agents de ciblage qui se lient spécifiquement à des marqueurs de surface cellulaire impliquées dans le transport. Ici, nous fournissons des méthodes pour mesurer l'ampleur et le mécanisme du transport NC à travers une barrière cellulaire modèle, la WHIch est constitué d'une monocouche de gastro-intestinal (GI) de cellules épithéliales cultivées sur une membrane poreuse située dans un insert Transwell. Formation d'une barrière de perméabilité est confirmée par la mesure de la résistance trans-épithéliale électrique (TEER), le transport transépithélial d'une substance de contrôle, et l'immunomarquage des jonctions serrées. A titre d'exemple, ~ 200 nm CN polymères sont utilisés, qui portent une cargaison thérapeutique et sont revêtues d'un anticorps qui cible un déterminant de surface cellulaire. L'anticorps ou de la cargaison thérapeutique est marqué avec ¹²⁵ I pour radio-isotope le traçage et les coordonnateurs nationaux marqués sont ajoutés à la chambre haute sur la monocouche de cellules pour des périodes variables. CN associés aux cellules et / ou transportés à la chambre sous-jacente peut être détectée. Mesure de libre ¹²⁵ I permet la soustraction de la fraction dégradée. La voie paracellulaire est évaluée par la détermination de changements potentiels causés par le transport NC pour les paramètres de barrière décrits ci-dessus. Transcellulaire transports is déterminé en abordant l'effet de moduler endocytose et la transcytose voies.

Introduction

Barrières cellulaires dans le corps agissent comme une passerelle entre l'environnement extérieur et compartiments internes. C'est le cas pour la muqueuse épithéliale séparant la surface externe exposée de la gastro-intestinal (GI) et dans la circulation sanguine ^1-3. Des barrières cellulaires représentent également l'interface entre le sang et le parenchyme et les composants cellulaires de tissus et d'organes. C'est le cas pour le revêtement endothelial interne des vaisseaux sanguins, telles que la barrière hémato-pulmonaire, la barrière hémato-encéphalique, etc ¹ La capacité à traverser ces barrières cellulaires da....

Protocole

Une. La culture d'une monocouche de cellules dans TRANSWELL Inserts

1. Dans un niveau de biosécurité 2 cellule culture hotte stérile, placer 0,8 mm pores PET TRANSWELL inserts dans une plaque de 24 puits (4 puits par condition, la signification statistique) avec une pince. Tous les matériaux entrant dans la hotte doivent être stérilisés avec de l'éthanol.

Remarque: La taille des pores du filtre doit être sélectionnée en accord à la taille moyenne de la NC utilisées, pour permettre le transport à travers la membrane. En outre, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, chaque condition expérimentale....

Résultats

Comme validation de notre modèle cellulaire pour étudier le transport transépithélial de CN ciblées, la figure 2 montre que les cellules Caco-2 Des monocouches de cellules étalées à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules / cm ² atteint la confluence ~ Jour 12 et maintenu l'intégrité de la monocouche jusqu'au jour 18, indiqué par la TEER (Figure 2A). Cela a été validé par la présence de jonctions serrées occludines positif (figure 2B) dans les m.......

Discussion

En utilisant les méthodes discutées ci-dessus, un modèle cellulaire pour l'étude du transport des commandes numériques ciblées à travers les barrières cellulaires peut être établi, tel que l'exemple fourni pour Caco-2 des cellules epitheliales, ce qui est pertinent pour l'évaluation du transport de la lumière du GI dans le sang, dans le cas des systèmes d'administration de médicaments par voie orale. Mise en culture des monocouches de cellules épithéliales gastro-intestinal dans des inserts Transwell act.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Transwell insère	BD Falcon	353095	;
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM	;
Sérum fœtal bovin (FBS)	Cellgro	35-015-CV	;
Stylo streptocoque	gibco	15140	;
Cellules d’adénocarcinome colorectal épithélial humain (Caco-2)	ATCC	HTB-37TM.
125Iode	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Danger radioactif
Tampon phosphate salin (PBS)	Gibco	14190-235	;
Albumine sérique bovine (BSA)	Equitech Bio	BAH-66	;
Paraformaldéhyde (16 %)	Fisher Scientific	15710	;
Immunoglobuline G (IgG) de sourisJackson	ImmunoResearch	015-000-003	;
Anticorps monoclonaux de souris dirigés contre l’ICAM-1 humain (anti-ICAM)	Marlin 1987		;
&alpha ;-Galactosidase, à partir de grains de café vert	Sigma	G8507-25UN	;
Perles de latex FITC, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150	;
Triton X-100	Sigma	234729-500ML	²
Acide trichloracétique (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500	;
Anticorps occludine (Y-12), chèvre polyclonal anti-humain	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151	;
Monodansylcadavérine (MDC)	Sigma	D4008	;
	Filipin Sigma	F9765	² ;
5-(N-éthyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA)	Sigma	A3085	;
Wortmannin	Sigma	W1628	;
Compteur gamma	Perkin Elmer	Wizard2	;
Volt-ohmmètre	World Precision Instruments	EVOM2	;
Électrodes TEER	World Precision Instruments	STX100	Électrodes disponibles pour différentes plaques à puits
Diffusion dynamique de la lumière (DLS)	Malvern	Nano-ZS90	;