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Article de méthode

Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère

12.2K vues

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DOI :

10.3791/50641

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27 juillet 2014

 ,  ,  ,  , 
1Veterans Administration Medical Center, San Diego, 2Department of Neurosciences, University of California, San Diego

Dans cet article

Résumé

des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.

Résumé

Les cellules souches neurales (NSC) peuvent s'auto-renouveler et de se différencier en neurones et cellules gliales. CNS transplantés peuvent remplacer les neurones perdus et de la glie après une blessure de la moelle épinière (SCI), et peuvent former des relais fonctionnels de renouer segments de la moelle épinière au-dessus et au-dessous d'une lésion. Des études antérieures de greffe de cellules souches neurales ont été limitées par la survie du greffon incomplète dans la cavité de lésion de la moelle épinière. En outre, le suivi de la survie des cellules de la greffe, la différenciation, et l'extension du procédé n'a pas été optimisée. Enfin, dans des études antérieures, NNC de rat en culture ont été typiquement rapportés à se différencier en cellules gliales lorsque greffé sur la moelle épinière lésée, plutôt que de neurones, à moins que le destin a été conduit à un type de cellule spécifique. Pour répondre à ces questions, nous avons développé de nouvelles méthodes pour améliorer la survie, l'intégration et la différenciation des CNS à des sites de même sévère SCI. NSC ont été fraîchement isolés de jour embryonnaire 14 moelle épinière (E14) d'une lignée transgénique stable Fischer 344 de rat exprimant fl vertuo-protéine (GFP) et ont été intégré dans une matrice de fibrine contenant des facteurs de croissance; cette formulation visant à conserver les cellules greffées dans la cavité de lésion et de soutenir la survie des cellules. NNC dans le cocktail fibrine / de facteur de croissance ont été implantés deux semaines après thoracique de niveau 3 (T3) complets transections de la moelle épinière, ce qui évite les périodes de pointe de l'inflammation. Greffons résultant complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en neurones, les axones qui s'étendaient dans l'hôte de la moelle épinière sur remarquablement longues distances, et les cellules gliales. Les greffes de NNC humaines en culture exprimant la GFP ont abouti à des conclusions similaires. Ainsi, les méthodes sont définies pour l'amélioration de la greffe de neurones sur les cellules souches, la survie et l'analyse des résultats in vivo.

Introduction

Lésions de la moelle épinière (SCI) souvent des dommages non seulement étendues de la substance blanche qui transportent les signaux de et vers le cerveau, mais aussi la substance grise centrale, causant la perte segmentaire des interneurones et les neurones moteurs. La conséquence de la SCI est la perte à la fois de la fonction motrice et sensorielle dessous de la lésion. Malheureusement, le système nerveux central adulte (CNS) ne se régénère pas spontanément, entraînant des déficits fonctionnels permanents 1. Par conséquent, la reconstruction de l'adulte blessé de la moelle épinière et l'amélioration des moteurs, sensoriels et la fonction autonome est un objectif important de la recherche SCI. Les cellules souches neurales (NSC), que ce soit directement isolé à partir de l'embryon ou du SNC adulte, sont des cellules candidats convaincants pour remplacer les neurones perdus et les cellules gliales. En outre, ces cellules ont la capacité de former de nouveaux relais fonctionnels pour rétablir la conduction axonale à travers une 2,3 de site de la lésion.

À ce jour, il n'a pas été avoir détaillé le anatomique, electrophysiologiques et effets comportementaux de la formation des neurones de relais par NNC transplantés après la grave SCI. Il ya plusieurs raisons à cela: d'abord, NNC ou tissu transplanté CNS fœtale survivre mal quand greffé dans de grandes cavités de la lésion. Des études antérieures montrent une perte précoce des cellules importante, laissant de grands vides kystiques cavités de lésions 4,5. Dans certaines études, les cellules greffées seraient ensuite diviser et remplir la cavité de la lésion 4,5, mais cela peut se produire après un délai de quelques jours ou semaines, et après le remplissage du site de la lésion peuvent ne pas être complète ou cohérente. Deuxièmement, un système de suivi efficace qui fournit des données fiables sur la survie cellulaire, la différenciation / maturation, et l'excroissance de transplanté CNS a fait défaut. La plupart des études antérieures utilisés antérograde et rétrograde étiquetage de retracer projections axonales des greffes 2,3. Cependant, ces techniques que partiellement et souvent peu claire projections axonales étiquetés provenant de cellules greffées et méthodes de traçage sont subjectivest pour les défauts causés par une fuite de colorant au-delà des cellules implantées. D'autres groupes ont utilisé des marqueurs neuronaux spécifiques relatives à étiqueter projections axonales après la transplantation de NSC fœtus humains dans la moelle épinière lésée rongeur 5,6. Cependant, dans ces études, les xénogreffes ne survivent pas toujours bien. Récemment, la livraison virale du gène rapporteur GFP a été utilisé pour étiqueter CNS culture 7,8. Cependant, l'expression GFP était souvent incompatible et peut être régulée à la baisse 7. Récemment, l'utilisation de la souris ou de rats donneurs transgéniques exprimant de façon stable le gène rapporteur GFP, ou la phosphatase alcaline placentaire humaine, a considérablement amélioré le suivi des cellules souches neurales / progéniteurs transplantées in vivo 9,11. En troisième lieu, plusieurs études indiquent que NSCs de rat en culture in vitro, soit à partir de dérivés embryonnaires ou adultes du SNC différencier en lignées exclusivement gliales lorsqu'elles sont transplantées dans le milieu de l'adulte intacte ou lésée cor moelled 7,12,13, en dépit du fait que ces cellules souches neurales sont capables de se différencier en neurones et les cellules gliales in vitro, ce qui indique que les environnements locaux peuvent dicter le sort des cellules souches. Alternativement, les CNS de culture, en particulier ceux issus de la SNC adulte, peuvent avoir la propriété de defaulty intrinsèque à se différencier en lignées gliales in vivo 13.

En raison des limitations évoquées ci-dessus, notre groupe a récemment développé un nouveau protocole pour améliorer le suivi embryonnaire NSC, la survie et la différenciation / maturation dans la moelle épinière adulte gravement blessé. En bref, nous avons commencé avec une ligne transgénique rat Fischer 344 de consanguinité stable exprimant un gène rapporteur de la GFP qui soutient expression de la GFP après transplantation in vivo 14. Ensuite, nous avons utilisé CNS fraîchement isolés du jour embryonnaire 14 Fischer 344 de la moelle épinière, un stade de développement qui conserve le potentiel de générer deux neurones et cellules gliales. Enfin, nous avons intégréNSCs fraîchement dissociées en une matrice de fibrine contenant des facteurs de croissance de 15 à 17 pour retenir les cellules et de les distribuer uniformément au sein d'une grande cavité de lésion, en vue de soutenir la survie des cellules de greffe, de la différenciation et de l'intégration. Les greffes ont été placées dans les sites de T3 section complète, deux semaines après la lésion de la moelle épinière. Ces cellules greffées constamment remplis sites de section complète et différenciées en neurones abondantes qui s'étendait un grand nombre d'axones en hôte de la moelle épinière sur de longues distances 18. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant des greffons en culture de cellules souches neurales humaines à des rats immunodéficientes 18.

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Protocole

Tous les protocoles d'animaux sont approuvés par VA-San Diego institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC). Directives du NIH pour laboratoire soins et la sécurité des animaux sont strictement suivies. Les animaux ont un accès libre à la nourriture et de l'eau tout au long de l'étude et sont convenablement traitées pour minimiser la douleur et l'inconfort.

1. Préparation de fibrine composants contenant du facteur de croissance Cocktails

  1. Dissoudre 25 mg de fibrinogène de rat dans 0,5 ml de PBS pour obtenir 50 mg / ml solution stock 2x (voir le tableau des matériaux). Le fibrinogène est difficile à dissoudre, et doit être placé dans un incubateur à bain-marie ou à 37 ° et on l'agite tout 5-10 min pendant 1-2 heures.
  2. Dissoudre 100 thrombine rat des Nations Unies dans 2 ml de 10 mM stérile CaCl 2 pour obtenir 50 U / ml 2x solution stock.
  3. Dissoudre les facteurs de croissance dans du PBS aux concentrations suivantes pour obtenir une solution de 100 pi de stock: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (concentration élevée d'actions en perfusion intrathécale in vivo 19); 200 pg / ml: GDNF; IGF; bFGF; FEM; PDGF; aFGF; HGF (environ 1000 x supérieur à celui utilisé pour la culture de cellules).
  4. Dissoudre 25 mg MDL28170 (inhibiteur de calpaïne) dans 1,3 ml de DMSO pour obtenir mM DMSO solution stock 50, puis diluer 50 fois dans du PBS pour obtenir une solution mM.
  5. Mélanger 100 ul de chacune des composantes du facteur de croissance et de 100 pi de MDL28170 (Traduction de solution à 1 mM) pour produire une solution du facteur de croissance de cocktail 1000 pi (figure 1).
  6. Mélanger 500 pi fibrinogène 2x solution mère avec une croissance de 500 pi facteur cocktail pour obtenir une solution à 25 mg / ml de travail fibrinogène contenant des facteurs de croissance et aliquote dans 10 ou 20 pi pour le stockage à -70 ° C. La solution est stable pendant jusqu'à 12 mois à -70 ° C.
  7. De même, mélanger 500 pi thrombine 2x de solution concentrée avec 500 pi facteur de croissance cocktail pour obtenir une solution de travail 25 U / ml de thrombine contenant des facteurs de croissance et en volumes aliquote de 10 ou 20 pi similaires pour le stockage d'unet -70 ° C pendant jusqu'à 12 mois.
  8. Le jour de la greffe, placer cocktails de fibrinogène et de facteur de croissance contenant de la thrombine sur de la glace jusqu'à obtenir un mélange avec des cellules.

2. T3 moelle épinière Transection

  1. Anesthésier les femmes adultes rats Fischer 344 ou rats nus thymoprives utilisant des méthodes acceptables. Les sujets sont profondément anesthésiés, quand la réactivité à la queue et la patte de pincement sont totalement absents. Remarque: Nous utilisons généralement 150-200 g rats Fischer ou 180-220 g rats athymiques, et un cocktail d'anesthésie (2 ml / kg) de kétamine (25 mg / ml), la xylazine (1,3 mg / ml) et l'acépromazine (0,25 mg / ml).
  2. Appliquer une pommade oculaire à prévenir la sécheresse ou de blessure des yeux tandis que les animaux sont sous anesthésie.
  3. Raser la région thoracique supérieure et nettoyer la peau à la Bétadine.
  4. Coupez la peau et des muscles en utilisant # 15 lame, exposer T3 vertèbre en utilisant un écarteur chirurgical, et d'effectuer une laminectomie au T3 vertèbre pour exposer T3 / 4 de la moelle épinière en utilisant un rongeur.
  5. Faire une londinale incision médiane dans la dure-mère d'environ 2 mm de longueur à l'aide d'une lame n ° 11.
  6. Placez iridectomie ciseaux sous la dure-mère à couper le latéral droit toute la moelle épinière. Faire une autre coupe du même côté 1,5 mm plus cadually.
  7. Aspirer le tissu de la moelle épinière entre les deux segments de coupe avec une aiguille 23 G émoussé connecté à vide d'intensité modérée. Utilisez vérification visuelle pour s'assurer section complète sur le ventre et latéralement. Cela viendra compléter une hémisection latérale.
  8. Pour prolonger la lésion à une résection pleine largeur moelle épinière, placez incisions de miroir dans le hemicord gauche. Tenter de laisser la dure-mère intacte, autre que la première coupe, pour retenir la matrice greffé / fibrine solide dans le site de la lésion lorsque greffé deux semaines plus tard.
  9. Suturer le muscle, appliquer la poudre antibiotique et agrafer la peau.
  10. Injecter lactate (3 ml) de Ringer, Bannamine (2,5-5 mg / kg) et l'ampicilline (80-100 mg / kg) (voir le tableau des matériaux) immédiatement après la chirurgie et mairats ntain dans un incubateur chaud jusqu'à ce que la thermorégulation est rétablie.
  11. Vider la vessie et injecter la solution de Ringer et ampicilline deux fois par jour pendant environ deux semaines jusqu'à ce que la mise en place de la vessie réflexe de vidange (figure 1B).

3. Préparation de la Journée fraîchement dissociées embryonnaire 14 moelle épinière Neural Stem Cells

  1. Obtenir consanguins transgéniques GFP rats F344 (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) de ressources et Rat Research Center, University of Missouri.
  2. Injecter 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone ethylamide (LHRH) dilué dans du PBS à une concentration de 200 pg / ml par voie intrapéritonéale (IP) par rat femelle mature (8 semaines ou plus) après 2 lumière induction -3 h pour la synchronisation de collecte d'embryons.
  3. S'accoupler avec une GFP nuit de rat maturité homozygote ou hétérozygote mâle 4 jours après l'injection.
  4. Recueillir des embryons à jours de 13,5 à 14,5 coït(PC) dans un tampon HBSS froid, examiner l'expression de la GFP sous un des verres "Nightsea" lampe de poche et de filtrage (BLS1 - BlueStar Lampe de poche et filtre barrière Modèle VG1) ou un microscope à fluorescence.
  5. Disséquer la moelle épinière dans des conditions aseptiques de chaque fœtus GFP-positives et éliminer méninges qui recouvrent et attaché ganglions rachidiens avec des ciseaux iridectomie et bijoutiers pince fine.
  6. Recueillir les moelles épinières disséqués en 2 ml de tampon HBSS froid dans un tube de 15 ml Cornical et garder sur la glace.
  7. Suivez référence n ° 20 à dissocier la moelle épinière disséqués:
    1. Brièvement, ajouter 2 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans le tube contenant la moelle épinière disséquées (plusieurs cordons peuvent être digérés ensemble, une corde peut générer suffisamment de cellules pour une greffe de matière) et à digérer à 37 ° C pendant 10 à 12 min.
    2. Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS dans le tube et centrifuger le tissu à 2 500 rpm pendant 2 min.
    3. Reprendre le tissu dans 2 ml Neurobasal milieu de containing 2% B27, et triturer le tissu de la moelle épinière en utilisant progressivement plus petites pipettes Pasteur poli-feu.
    4. Centrifuger les cellules à 2500 rpm pendant 2 min, remettre en suspension dans 2 ml de milieu Neurobasal contenant B27, et des cellules de filtration d'un filtre à tamis cellulaire de 40 pm.
  8. Compter les cellules avec un hémocytomètre et diviser les cellules de façon égale en deux tubes Eppendorf.
  9. Centrifuger les cellules et supprimer complètement surnageant (1-2 min sont tenus de retirer tout surnageant avec une pointe à vide faible) de sorte que les cocktails de facteurs de croissance ne seront pas dilués par surnageant restant après cellule re-suspension.
  10. Remettre en suspension chaque moitié des cellules dans le fibrinogène ou de la solution de travail de thrombine contenant les facteurs de croissance, respectivement, à une concentration de 250 000 cellules / ul (les chiffres de culots cellulaires d'environ ⅓ volume final) et les placer sur de la glace transplantation antérieur (figure 1A). Notez que le fibrinogène peut spontanément gel lorsqu'il est mélangé avec cellules avant de combiner avec de la thrombine sur le site lésion / greffe; pour éviter une gélification prématurée, mélanger cellules fibrinogène immédiatement avant la greffe de cellules in vivo.

4. Transplantation

  1. Réexposer la lésion T3 / 4 de la moelle épinière, deux semaines après résection de la moelle épinière.
  2. 5-fibrinogène et des cellules de 5 ul des cellules de la thrombine ul pourraient être injectés directement dans neuf points du site de la lésion à travers le tissu de cicatrice et dure-mère intacte étanche sans ré-ouvrir le site de la lésion.
  3. Utilisez une aiguille 27 G pour créer 9 trous sur la surface du tissu cicatriciel et la durée intact 1-2 semaines après la lésion: 3 dans le centre (un point milieu et deux latérales dans, et espacées de 0,5 mm de distance) et 3 dans les deux rostrale et 3 à l'interface caudale (environ 0,5 mm rostral ou caudale par rapport à l'axe de la lésion).
  4. Puis injecter la moitié du volume de solution de cellule de fibrinogène en trois points centraux du site de la lésion et un volume de quart en trois points de l'interface rostrale et aqvolume de TRIMESTRE en 3 points de l'interface caudale.
  5. Puis, injecter immédiatement cellules throbmbin dans les mêmes endroits. Le mélange de cellules de fibrinogène et de la thrombine de cellules à l'intérieur du site de la lésion va former un gel de fibrine pour maintenir les cellules dans le site de la lésion et les cocktails de facteurs de croissance supportant la survie des cellules. Les cellules sont injectées à l'aide de pipettes de verre tiré connectés à un Picospritzer (General Valve, Inc.).
  6. Transplantation CNS humaines en culture 21 dans la même procédure décrite ci-dessus, et utiliser la fibrine et le facteur de croissance cocktails à base de réactifs d'origine humaine.

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Résultats

GFP marquage immunohistochimique démontre que NSC de rat greffé remises en suspension dans du tampon phosphate salin (PBS) (dépourvu d'une matrice de fibrine et des facteurs de croissance) ont survécu mal dans le site de résection de T3, seule la fixation de la marge de lésion / hôte et en laissant la majeure partie du site de la lésion vide sans cellules greffées (Figure 2A). La survie de NNC améliorée en cas de co-greffé avec seulement des matrices de fibrine, mais la greffe n'a pas complèteme...

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Discussion

L'un des principaux obstacles pour NSC transplantation de la moelle épinière est faible taux de survie dans le centre de la lésion. Des lacunes ou des cavités dans le site de la lésion pourraient réduire ou affaiblir la formation de relais neuronaux fonctionnels entre les axones et supraspinales séparés segments de la moelle épinière en dessous de la blessure. En outre, la faible survie des greffés CNS pourrait influer sur leur intégration avec les tissus de l'hôte, et donc de réduire la connectivité des neurone...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Nous remercions le Rat des ressources et Centre de recherche de l'Université du Missouri, Columbia, Missouri, pour fournir des rats GFP; Neuralstem Inc. pour fournir des cellules souches neurales humaines. Ce travail a été soutenu par l'Administration des anciens combattants, le NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondation Craig H. Nielsen, et le Bernard et Anne Spitzer Charitable Trust.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Fibrinogène (rat)SigmaF6755-25MG2 h à 37 ° ; C à dissovle
Concentration stock : 50 mg/ml
Concentration finale : 25 mg/ml
Thrombine (rat)SigmaT5772-100UNDissovle in 10 mM CaCl2
Concentration stock : 50 U/ml
Concentration finale : 25 mg/ml
bFGF (humain)SigmaF0291 (25 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
EGF (murine)SigmaE1257 (0,1 mg)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
BDNF (humain)Peprotech452-02 (1 mg)Concentration du stock : 1 000 ng/&mu ; l
Concentration finale : 50 ng/&mu ; l
NT-3 (humain)Peprotech452-03 (1 mg)Concentration du stock : 1 000 ng/&mu ; l
Concentration finale : 50 ng/&mu ; l
GDNF (rat)SigmaG1401 (10 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
IGF-1 (souris)SigmaI8779 (50 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
aFGF (humain)SigmaF5542 (25 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
PDGF-AA (humain)SigmaP3076 (10 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
HGF (humain)SigmaH9661 (5 μ ; g)Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l
Concentration finale : 10 ng/&mu ; l
MDL28170SigmaM6690 (25 mg)Stock en DMSO
Concentration en stock : 1 mM
Concentration finale : 50 &mu ; M
PBSMilliporeBSS-1005-BConcentration stock : 1x
Concentration finale : 1x
DMSOSigmaD2650
KetaminePutney26637-411-0140-80 mg/kg
Concentration stock : 100 mg/ml
Concentration finale : 25 mg/ml
XylazineLloyd0410,2,5-8 mg/ml
Concentration stock : 100 mg/ml
Concentration finale : 5,8 mg/ml
AcépromazineButler0038450,5-4 mg/ml
Concentration stock : 10 mg/ml
Concentration finale : 0,25 mg/ml
BetadineHealthpetsBET16OZ
RingersAbbott04860-04-102-3 ml/inj
BanamineSchering-Plough0061-0851-032,5-5 mg/kg
Concentration stock : 50 mg/ml
Concentration finale : 0,5 mg/ml
AmpicillineSandoz0781-3404-8580-100 mg/kg
Concentration finale : 50 mg/ml
LH-RHSigmaL4513200 &mu ; g/kg
Concentration finale : 200 &mu ; g/ml
HBSSGibco14175-096
TrypsineGibco25200056Concentration stock : 0,25 %
Concentration finale : 0,125 %
DMEMGibco11995073
FBSGibco16000044 Concentration stock : 100 %
Concentration finale : 10 %
Milieu neurobasalGibco21103049
B27Gibco17504044Concentration du stock : 100x
Concentration finale : 1x
Remarque, utilisez des réactifs humains pour les greffes de CSN humains

Références

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