des matrices de fibrine contenant des facteurs de croissance ont été utilisés pour conserver des cellules souches neurales dans des sites greffés complète de transection de la moelle épinière. Cellules greffées complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en plusieurs types de cellules neurales, y compris les neurones qui s'étendaient axones dans la moelle épinière hôte sur de longues distances.
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Article de méthode
Promotion de la survie et de la différenciation des cellules souches neurales de fibrine et du facteur de croissance Cocktails après Spinal Cord Injury sévère
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches neurales (NSC) peuvent s'auto-renouveler et de se différencier en neurones et cellules gliales. CNS transplantés peuvent remplacer les neurones perdus et de la glie après une blessure de la moelle épinière (SCI), et peuvent former des relais fonctionnels de renouer segments de la moelle épinière au-dessus et au-dessous d'une lésion. Des études antérieures de greffe de cellules souches neurales ont été limitées par la survie du greffon incomplète dans la cavité de lésion de la moelle épinière. En outre, le suivi de la survie des cellules de la greffe, la différenciation, et l'extension du procédé n'a pas été optimisée. Enfin, dans des études antérieures, NNC de rat en culture ont été typiquement rapportés à se différencier en cellules gliales lorsque greffé sur la moelle épinière lésée, plutôt que de neurones, à moins que le destin a été conduit à un type de cellule spécifique. Pour répondre à ces questions, nous avons développé de nouvelles méthodes pour améliorer la survie, l'intégration et la différenciation des CNS à des sites de même sévère SCI. NSC ont été fraîchement isolés de jour embryonnaire 14 moelle épinière (E14) d'une lignée transgénique stable Fischer 344 de rat exprimant fl vertuo-protéine (GFP) et ont été intégré dans une matrice de fibrine contenant des facteurs de croissance; cette formulation visant à conserver les cellules greffées dans la cavité de lésion et de soutenir la survie des cellules. NNC dans le cocktail fibrine / de facteur de croissance ont été implantés deux semaines après thoracique de niveau 3 (T3) complets transections de la moelle épinière, ce qui évite les périodes de pointe de l'inflammation. Greffons résultant complètement remplis la cavité de la lésion et différenciées en neurones, les axones qui s'étendaient dans l'hôte de la moelle épinière sur remarquablement longues distances, et les cellules gliales. Les greffes de NNC humaines en culture exprimant la GFP ont abouti à des conclusions similaires. Ainsi, les méthodes sont définies pour l'amélioration de la greffe de neurones sur les cellules souches, la survie et l'analyse des résultats in vivo.
Introduction
Lésions de la moelle épinière (SCI) souvent des dommages non seulement étendues de la substance blanche qui transportent les signaux de et vers le cerveau, mais aussi la substance grise centrale, causant la perte segmentaire des interneurones et les neurones moteurs. La conséquence de la SCI est la perte à la fois de la fonction motrice et sensorielle dessous de la lésion. Malheureusement, le système nerveux central adulte (CNS) ne se régénère pas spontanément, entraînant des déficits fonctionnels permanents 1. Par conséquent, la reconstruction de l'adulte blessé de la moelle épinière et l'amélioration des moteurs, sensoriels et la fonction autonom....
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Protocole
Tous les protocoles d'animaux sont approuvés par VA-San Diego institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC). Directives du NIH pour laboratoire soins et la sécurité des animaux sont strictement suivies. Les animaux ont un accès libre à la nourriture et de l'eau tout au long de l'étude et sont convenablement traitées pour minimiser la douleur et l'inconfort.
1. Préparation de fibrine composants contenant du facteur de croissance Cocktails
- Dissoudre 25 mg de fibrinogène de rat dans 0,5 ml de PBS pour obtenir 50 mg / ml solution stock 2x (voir le tableau des matériaux). Le fibrinogène....
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Résultats
GFP marquage immunohistochimique démontre que NSC de rat greffé remises en suspension dans du tampon phosphate salin (PBS) (dépourvu d'une matrice de fibrine et des facteurs de croissance) ont survécu mal dans le site de résection de T3, seule la fixation de la marge de lésion / hôte et en laissant la majeure partie du site de la lésion vide sans cellules greffées (Figure 2A). La survie de NNC améliorée en cas de co-greffé avec seulement des matrices de fibrine, mais la greffe n'a pas complèteme.......
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Discussion
L'un des principaux obstacles pour NSC transplantation de la moelle épinière est faible taux de survie dans le centre de la lésion. Des lacunes ou des cavités dans le site de la lésion pourraient réduire ou affaiblir la formation de relais neuronaux fonctionnels entre les axones et supraspinales séparés segments de la moelle épinière en dessous de la blessure. En outre, la faible survie des greffés CNS pourrait influer sur leur intégration avec les tissus de l'hôte, et donc de réduire la connectivité des neurone.......
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Déclarations de divulgation
Nous n'avons rien à communiquer.
Remerciements
Nous remercions le Rat des ressources et Centre de recherche de l'Université du Missouri, Columbia, Missouri, pour fournir des rats GFP; Neuralstem Inc. pour fournir des cellules souches neurales humaines. Ce travail a été soutenu par l'Administration des anciens combattants, le NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, la Fondation Craig H. Nielsen, et le Bernard et Anne Spitzer Charitable Trust.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Fibrinogène (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 h à 37 ° ; C à dissovle Concentration stock : 50 mg/ml Concentration finale : 25 mg/ml |
| Thrombine (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Concentration stock : 50 U/ml Concentration finale : 25 mg/ml |
| bFGF (humain) | Sigma | F0291 (25 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0,1 mg) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| BDNF (humain) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Concentration du stock : 1 000 ng/&mu ; l Concentration finale : 50 ng/&mu ; l |
| NT-3 (humain) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Concentration du stock : 1 000 ng/&mu ; l Concentration finale : 50 ng/&mu ; l |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| IGF-1 (souris) | Sigma | I8779 (50 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| aFGF (humain) | Sigma | F5542 (25 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| PDGF-AA (humain) | Sigma | P3076 (10 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| HGF (humain) | Sigma | H9661 (5 μ ; g) | Concentration du stock : 200 ng/&mu ; l Concentration finale : 10 ng/&mu ; l |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock en DMSO Concentration en stock : 1 mM Concentration finale : 50 &mu ; M |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Concentration stock : 1x Concentration finale : 1x |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Concentration stock : 100 mg/ml Concentration finale : 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2,5-8 mg/ml Concentration stock : 100 mg/ml Concentration finale : 5,8 mg/ml |
| Acépromazine | Butler | 003845 | 0,5-4 mg/ml Concentration stock : 10 mg/ml Concentration finale : 0,25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2,5-5 mg/kg Concentration stock : 50 mg/ml Concentration finale : 0,5 mg/ml |
| Ampicilline | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Concentration finale : 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 &mu ; g/kg Concentration finale : 200 &mu ; g/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsine | Gibco | 25200056 | Concentration stock : 0,25 % Concentration finale : 0,125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 Concentration stock : 100 % Concentration finale : 10 % | |
| Milieu neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Concentration du stock : 100x Concentration finale : 1x |
| Remarque, utilisez des réactifs humains pour les greffes de CSN humains |
Références
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , New York: Hafner. (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local i....
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Réimpressions et autorisations
