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Article de méthode

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l'interface Air Liquide

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⸱

DOI :

10.3791/50646

⸱

8 octobre 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Résumé

Les modèles in vitro en utilisant des cellules epitheliales primaires humaines sont essentiels à la compréhension des fonctions principales de l'épithélium des voies respiratoires dans le cadre d'infections microbiennes ou des agents inhalés. Des comparaisons directes de cellules obtenues à partir de populations malades permettent de caractériser différents phénotypes et disséquer les mécanismes sous-jacents de médiation changements dans la fonction des cellules épithéliales. La culture de cellules épithéliales provenant de la région trachéo-bronchique humain a été bien documenté, mais est limitée par la disponibilité de tissu pulmonaire humain ou de caractère invasif associé à l'obtention de biopsies bronchiques les brosses. Cellules épithéliales nasales sont obtenus par biopsies superficielles nasale de gratter beaucoup moins invasives et les sujets peuvent être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants. En outre, le nez est le point pour le système respiratoire d'entrée et donc l'un des premiers sites à être exposés à tout type de stress d'origine atmosphérique, tels que des agents microbiens, polluants ou allergènes.

Brièvement, les cellules épithéliales nasales obtenues à partir de volontaires humains sont expansés sur des plaques de culture revêtues de tissu, et ensuite transférés sur des inserts de culture cellulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules continuent à être cultivées à l'interface air-liquide (ALI), pendant plusieurs semaines, ce qui crée plus physiologiquement conditions pertinentes. La condition de culture ALI utilise des milieux définis menant à un épithélium différencié qui présente des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à l'épithélium nasal humain, avec des cellules ciliées, et la fois la production de mucus. des inserts de culture tissulaire avec des cellules épithéliales nasales différenciées peuvent être manipulées dans une variété de façons en fonction des questions de recherche (traitement avec des agents pharmacologiques, la transduction avec des vecteurs lentiviraux, l'exposition à des gaz ou de l'infection par des agents microbiens) et analysés pour de nombreux paramètres différents, allant de voies cellulaires et moléculaires, ch fonctionnelleanges, morphologie, etc

Dans les modèles in vitro de cellules épithéliales nasales humaines différenciées permettra aux enquêteurs de répondre roman et questions de recherche importantes en utilisant des modèles expérimentaux organotypiques que reproduire en grande partie de l'épithélium nasal in vivo.

Introduction

Objectif de la technique

Les cellules épithéliales (ECS) dans les voies respiratoires sont parmi les premiers sites à être directement exposés à des facteurs de stress environnementaux inhalés, comme les agents pathogènes, des allergènes ou polluants atmosphériques. CE sont plus un obstacle structurel: Ils agissent comme un standard pour initier et réguler la réponse immunitaire respiratoire 1-3 par la libération de médiateurs solubles 4-6 et l'expression de ligands / récepteurs sur leur surfactant 7-9. Bien que des lignées de cellules immortalisées peuvent être utilisés comme modèles pour étudier les EC respiratoires in vitro, ils ne parviennent pas à se différencier en des populations cellulaires hétérogènes constitués de cellules ciliées polarisée et de la production de mucus, similaire à ce qui est observé in vivo. Pour résumer les caractéristiques importantes de l'épithélium respiratoire observée in vivo, les EC des voies respiratoires primaires peuvent être utilisées. Par conséquent, notre objectif était d'optimiser notre méthode utilisant nasale EC (CNE) a obtenu des volontaires humains. Les CNE sont étendues et mises en culture in vitro, ce qui donne un modèle de culture de cellules différenciées de CNE qui imite un grand nombre des caractéristiques de l'épithélium nasal vu in vivo.

Raisonnement

L'utilisation de modèles in vitro avec EC primaires humains imitant dans la situation in vivo - comme décrit dans cette étude - offre des possibilités uniques pour étudier les différences spécifiques de la maladie d'ECS, les paramètres physiologiques associés à l'épithélium des voies respiratoires, ou les interactions entre les CE et d'autres types de cellules, telles que les cellules dendritiques 10, les cellules tueuses naturelles 11 ou des macrophages. Plusieurs procédés existants utilisent les EC bronchiques, qui peuvent être obtenus par l'intermédiaire de biopsies invasive de la brosse au cours de bronchoscopies, ou à partir de tissus pulmonaires autrement mis au rebut 12 à 17. En outre, les sources commerciales pour obtenir des voies respiratoires humaines cultures de cellules épithéliales différenciées entièrement existent (Modèle EpiAirway de MatTek, Ashland, MA, Cloneticsde Lonza, Bâle, Suisse, MucilAir de Epithelix Sars, Genève Suisse), où les enquêteurs peuvent choisir parmi différents bailleurs de fonds. Cependant, à cause de la piscine limité de cellules épithéliales disponibles dans le commerce, limitées ou ensemble de paramètres prescrits, le coût associé à l'obtention commerce respiratoire humain primaire EC, et l'accès limité aux tissus pulmonaires jetés ou tissu fraîchement obtenue de biopsie bronchique humaine, interdisent de nombreux chercheurs de mener des études dans complètement différenciées EC des voies respiratoires humaines. Par conséquent, nous avons décidé de développer une technique qui 1) utiliser CNE humains non invasive obtenus, 2) fournir un protocole rendement des cultures de différenciée épithélium respiratoire humain, et 3) être reproductible dans la plupart des paramètres de laboratoire avec une infrastructure existante de culture de tissus.

Avantages par rapport aux techniques / modèles existants

Obtention CNE frais, par rapport à bronchique ou petit voies EC, est beaucoup moins invasive, individuels peut être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants, et des biopsies superficielles gratter nasales peuvent être menées dans des populations malades qui ne seraient pas admissibles à des bronchoscopies liées à la recherche. Non invasives biopsies superficielles gratter pour obtenir CNE permettent à l'enquêteur pour définir les spécifications des donateurs a priori, y compris l'âge, le sexe, l'état de la maladie, etc, conformément à l'objectif de la recherche à faire. Ainsi, lors de la conception des études de recherche enquêteurs ne sont pas limités par les tissus disponibles en clinique / de spécimens épithéliales, acheter des modèles de culture cellulaire différenciées coûteux auprès de fournisseurs commerciaux, ou la conception des études de bronchoscopie envahissantes. En outre, la facilité à obtenir CNE augmente la capacité de mener des expériences dans les cellules de différents bailleurs de fonds, ce qui améliore la validation statistique des résultats observés. Enfin, le nez est l'un des premiers sites à être exposés à toute sorte de facteurs de stress dans l'air. Ainsi, en générant organotypiqueLes systèmes de culture in vitro mimant l'épithélium nasal sont utiles pour étudier l'inhalation de particules virales, des polluants, des allergènes, ou des gaz, qui peuvent être facilement atteintes par l'utilisation de ce système de culture cellulaire.

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Protocole

Une. Préparer plastique Ware: Manteau Plate

  1. Ajouter 500 ul PureCol (1:100 dilué avec de l'eau stérile) dans chaque puits d'une plaque à 12 puits.
  2. Incuber à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min, retirer le PureCol et rincer avec du HBSS juste avant les cellules sont ajoutées à la plaque (voir l'étape 3.1 ci-dessous).

2. L'obtention et le prétraitement de biopsie de CNE humain

  1. Nasale gratter biopsie
    1. Obtenir EC superficielles qui tapissent les cornets nasaux sous vision directe à travers un spéculum réutilisable polypropylène nasale 9 mm (modèle 22009) sur un otoscope d'exploitation avec spéculum (modèle 21700). Ce dispositif fournit une visualisation optimale des fosses nasales et la flexibilité de mouvement.
    2. Effectuez les biopsies avec le sujet assis droit sur une chaise à dossier droit avec la tête légèrement basculée en arrière ou se trouvant dans une position couchée sur une table d'examen.
    3. Insérez le spéculum otoscope dans la narine et la turbi inférieureNate visualisé avec éclairage.
    4. Insérez une curette thermoplastique stérile à travers le spéculum avec la pointe distale étendu à l'arrière du cornet.
    5. En utilisant une légère pression sur la surface inférieure du cornet, la curette est attirée sur le 5x de surface de la muqueuse et rétracté. Une récupération réussie de cellules de la muqueuse détenus par capillarité sera évident dans la coupe de la curette.
  2. Placer l'échantillon dans un tube conique de 15 ml contenant 8 ml de RPMI 1640, le transport sur de la glace.
  3. Utilisez une pince pour récupérer la sonde, déloger les tissus de la sonde de rhinocéros avec une pipette P-1000, jeter la sonde
  4. Centrifugeuse pour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer le surnageant (attention: attention à ne pas aspirer le culot).
  5. Remettre en suspension le culot dans 1 ml BEGM avec 10 ul de DNase 1 100x.
  6. Incuber à température ambiante pendant 20 min.
  7. Centrifugeuse (4 ° C, 400 xg, 5 min), ne pas aspirer le surnageant!

3. SEED les cellules sur plastique (jour 0)

  1. Retirez le PureCol de la plaque et rincer avec du HBSS (voir aussi l'étape 1.2).
  2. Ajouter un volume minimal de supports BEGM + + (80 à 100 ul, jusqu'à ce qu'un ménisque de support apparaît au centre du puits) dans les puits 1-4 (selon la taille de biopsie) de la plaque revêtue.
  3. Utiliser une pipette P-1000 pour retirer délicatement le culot du tissu de biopsie du tube, sans aspirer trop médias.
  4. Transférer le culot dans le milieu des puits, garder la biopsie ensemble comme un amas de cellules, et ne pas casser pour faire une suspension cellulaire unique. A de bons rendements biopsie jusqu'à 4 puits qui peuvent être ensemencés. Placer la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire (37 ° C, 5% CO 2,> 90% d'humidité relative).
  5. Vérifiez après deux heures afin d'assurer qu'il ya suffisamment de médias (sans perturber le ménisque).
  6. Jour 1, 24 h après l'ensemencement: collecter toutes les cellules non-adhérentes de tous les puits (plaque d'inclinaison et de recueillir les médias avec des cellules dans un P-1000, collect tous les puits dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse).
  7. Centrifuger (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Alors que la centrifugation de la suspension de cellules: ajouter 250 ul d'BEGM + + et 250 ul de mélange de médias BEGM + aux cellules ensemencées le jour 0.
  9. Répéter les étapes 3.1 à 3.5 pour les cellules non adhérentes.
  10. Jour 2-5: changement médias des cellules quotidiennes; ajouter 500 médias ul à chaque puits, réduire la quantité de BEGM + + par étapes de médias (jour 2 après le semis: 125 pi BEGM + + plus 375 pi BEGM +, day3 après le semis, et les jours suivants: 73 ul BEGM + + plus 427 pi BEGM +).

4. L'expansion des cellules dans les flacons

  1. Surveillance de cellules par jour, une fois qu'ils ont atteint 80-90% de confluence (habituellement 5-7 jours après la biopsie, si elles prennent plus de temps qu'ils ne poussent pas avec succès) les cellules de levage comme suit: médias soigneusement aspirer, ajouter 500 ul de trypsine à 0,25% par bien, gardez-les à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont détachées (cela prend habituellement 2-3 min).
  2. Préparer la nécessitéle volume de haricot de soja ed inhibiteur de trypsine (SBTI) (750 pi par ml de trypsine 1) dans un tube de 15 ml.
  3. Déloger les cellules par pipetage de haut en bas plusieurs fois la solution de trypsine; transfert de cellules individuelles dans le tube conique de 15 ml avec SBTI.
  4. Rincez tous les puits avec au total 1 ml de HBSS, ajouter HBSS au tube avec les cellules.
  5. Centrifugeuse pour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspirer les médias, remettre en suspension dans 1 ml BEGM + médias et le tube vortex.
  6. Développer cellules dans un flacon T25 ou T75 selon la grosseur des granules (c'est p1; environ deux puits confluentes aller dans un flacon T75, un confluent est bien assez pour un T25, généralement de 2 puits confluentes donnent un T75).
    1. Ajouter BEGM + pour les flacons (5 ml chacune pour un T75, 3 ml chacun pour un T25).
    2. Ajouter la suspension de cellules dans les flacons. Transférer les flacons dans un incubateur de culture tissulaire.
  7. 24 h post-ballon-semis: ajouter un média supplémentaire BEGM + dans le ballon (3 ml à un T25, 10 ml à un T75).
  8. maintenir les cellules dans les flacons: Retirez le support (aspiration du coin) et ajouter BEGM + médias (5 ml/T25, 20 ml/T75). Les médias doivent être changés tous les 2-3 jours. Maintenir les cellules dans la fiole jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à environ 80% (de confluence peut ne pas être encore tout au long du flacon; cela prend normalement entre 7-10 jours, si elles ne sont pas confluentes au bout de 10 jours, ils ne seront pas croître avec succès).

5. Ensemencer les cellules sur la culture tissulaire Inserts

  1. Retirez le support du ballon et ajouter la trypsine (3 ml pour T25, 4 ml pour flacon T75).
  2. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont décollées (environ 2-3 min).
  3. Préparer SBTI (750 ul pour 1 ml de trypsine> 2,25 ml pour T25, T75 pour 3 ml) dans un tube de 15 ml.
  4. Déloger les cellules en enroulant le ballon et le pipetage de haut en bas et de les transférer à tube conique avec le SBTI.
  5. Rincer la fiole avec du HBSS (1 ml pour T25, T75 2 ml d'), ajouter la HBSS au tube de 15 ml.
  6. Centrifugeusepour obtenir un culot (4 ° C, 400 xg, 5 min), enlever le surnageant avec précaution.
  7. Préparer les plaques: décider du nombre de plaques vont être tête de série, l'étiquette des plaques avec des exemples de code et le numéro, le numéro de passage (c.-à-p2) et la date. Ajouter 700 ul BEGM + médias à la chambre de base.
  8. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml médias BEGM ALI par vortex le tube.
  9. Compter les cellules avec un hémocytomètre (T25 produit habituellement environ 4 millions de cellules, un T75 peut avoir jusqu'à 20 millions de cellules en fonction de l'îlot; utiliser 1-2000000 des cellules pour une plaque de 12 puits) et diluer la suspension cellulaire avec médias BEGM Ali le volume total nécessaire pour la quantité de plaques qui doivent être ensemencées (1,2 x 10 6 cellules dans 2,5 ml de milieu par boîte) (Note:. Si une partie des cellules veulent être gelés, étiqueter le tube et éliminer les cellules ici: on gèle habituellement de 2 x 10 6 cellules dans 2 ml de gel médias)
  10. Ajouter 200 pi de suspension cellulaire sur le côté apical de chaque cellule Corning 12well non revêtueinsérer (> ce sera environ 80,000-150,000 cellules / insert; 12 mm transwells avec 0,4 um pores polyester (polyéthylène téréphtalate (PET)) de l'insert de membrane), le transfert de la culture de tissu incubateur.
  11. Après 24 heures, changer les médias apicale (200 milieu d'expansion pi).
  12. Le maintien des cultures de cellules: Changer les médias (BEGM ALI médias; 700 pi basolatéral et apical 200 pi) tous les deux jours. Inserts doivent être maintenus immergé jusqu'à ce que les cellules sont totalement confluent (pas de trous dans monocouche sont visibles). Selon le nombre de cellules ce qui prend habituellement entre 2-6 jours, si cela prend plus les cellules seront plus susceptibles de ne pas être viable.

6. Établir Air Interface liquide Une fois que les cellules sont complètement Confluent (lorsque les cellules sur les Transwells sont complètement Confluent)

  1. Une fois que les cellules sont complètement confluentes remplacer les deux médias apical et basolatéral avec les médias BEGM ALI complétées avec l'acide rétinoïque 500 nM pendant 48 heures.
  2. 48 heures après l'ajout de l'acide rétinoïque complété BEGM ALI médias: Préparer PneumaCult-ALI milieu d'entretien (les Instructions du fabricant ci-dessous): Calculer le volume de milieu nécessaire (pour une plaque habituellement 8,5 ml pour compartiments basales); ajouter par 1 ml PneumaCult base Milieu complet :

    Supplément de maintenance 10 pi PneumaCult 100x
    2 pl héparine (d'une solution stock de 2 mg / ml)
    5 ul d'hydrocortisone (d'une solution stock de 96 pl / ml).

  3. Retirez tous les supports et ajouter PneumaCult-ALI médias d'entretien de 700 pi sur le côté basolatéral uniquement (pas de support sur le côté apical).
  4. Maintenir les cultures de cellules de 4 semaines à l'ALI:
    1. Modifiez les médias tous les jours (lundi, mercredi et vendredi horaire fonctionne bien pour nous).
    2. Après une semaine à ALI, une fois par semaine (le mercredi) la surface apicale est rincé: ajouter 200 ul de HBSS du côté apical, gardez-les pendant 10 minutes dans l'incubateur, soigneusement aspirer leHBSS (utiliser un 9 en pipette en verre fixé au piège à vide dans l'enceinte de sécurité biologique, utiliser 200 conseils de pi sur le bout de la pipette pour aspirer au large de la HBSS).

Remarque: Changer conseils entre les plaques, ainsi que la modification des conseils lors du passage de la surface apicale par rapport à basolatérale. Après environ 2 semaines à l'ILA, les cellules commencent à se différencier et de cils apparaissent. Les cultures cellulaires atteignent différenciation complète après environ 4 semaines à l'ILA.

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Résultats

CNE cultivée en suivant le protocole décrit ici re-différencier en une couche hétérogène de EC composé de cellules ciliées et non ciliées, représentant la situation in vivo (Figure 1). Certains des CNE sont différenciées mucus de production (cellules colorées en bleu en utilisant AB / PAS, figure 1B). Même si le protocole présenté ici est optimisée, la différenciation peut varier en ce qui concerne la distribution des populations de cellules totales (c'est à dire l...

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Discussion

EC respiratoires fournissent non seulement une barrière physique pour protéger le corps humain de stimuli exogènes 20, mais aussi agir comme un standard pour initier et réguler les réponses respiratoires de défense immunitaire 1-3 via la sécrétion de médiateurs solubles ou des interactions cellule-cellule récepteur-ligand directs. Afin d'étudier le rôle des EC dans la réponse immunitaire, pour examiner les différences potentielles entre les EC des populations malades, ou pour étudier les effets...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Lisa Dailey pour les entrées utiles.

Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts nationaux de la santé (ES013611 et HL095163), l'agent de bord Institut de recherche médicale (FAMRI), et l'Environmental Protection Agency (CR83346301) et déclare aucun conflit d'intérêt. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Bien que la recherche décrite dans cet article a été financée en partie par l'Agence américaine de protection de l'environnement par le biais coopérative CR83346301 accord avec le Centre de médecine environnementale, de l'asthme et de la biologie du poumon à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, il n'a pas été soumis à la agence de pairs nécessaires et révision de la politique et ne reflète donc pas nécessairement les vues de l'agence, et aucune approbation officielle doit être déduite. Mention onoms commerciaux de f ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation à l'emploi. Loretta Müller est soutenu par le Fonds national suisse grâce à une subvention personnelle.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Spéculum nasalWelch AllynModèle 220099 mm, polyproylène réutilisable
Otoscope de fonctionnementWelch AllynModèle 21700
Cuvette de cellule de sonde rhinocérosArlington ScientificSY-96-092pliez la tête de la cuvette un peu plus
Plaques de culture à 12 puitsCorning3512
Inserts de culture cellulaire à membrane TranswellCorning3460
Fiole de culture tissulaire Corning430639 et 430641T25 et T75
Milieu ventilé RPMI 1640 (avec L-Glutamine)Gibco11875
Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques/trachéalescellules511-500
BEGM Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiquesLonzaCC-3170Il s’agit d’un kit composé d’une bouteille de fluide et de flacons avec des suppléments.
Bicarbonate de sodium 7,5 % solutionGibco25080Utiliser tel quel.
NuSerumBD Biosciences355104Utilisation telle quelle.
BAMBANKER Gel de milieuBAMBANKER BAMBANKER302-14681Utiliser tel quel.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(récipient de congélation cellulaire sans alcool CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Bdiluer 1:100 avec de l’eau stérile (devrait être d’environ 0,03 mg/ml)utiliser 500 &mu ; l/puits d’une plaque HBSS à 12 puits
avec Ca2 et Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25Dissoudre à 1,5 mg/ml, qui est une solution 100x, ajouter 10 &mu ; l à chaque ml de milieu
Trypsine, 0,25 %, 1x, avec rouge de phénolGibco25200-056Utilisation à l’inhibiteur
trypsine de soja (SBTI)SigmaT6522Utilisation dissoute dans HBSS à une concentration de 1 mg/ml
Acide rétinoïqueSigmaR7632Compléter 100 &mu ; M solution mère (voir ci-dessous), diluer à 10 &mu ; M avec de l’alcool absolu, prendre 5 &mu ; l de ceci et ajoutez-le à un milieu BEGM de 1 ml (notre solution de travail).

Le rétinol All-trans a un coefficient d’extinction de 52 480 dans l’éthanol à 325 nm. Dissoudre 25 mg dans 50 ml d’éthanol absolu. Des dilutions en série doivent être effectuées, diluer 50 ml de stock dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, et à nouveau prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 100 ml de celui-ci et diluer dans 900 ml d’éthanol absolu et lire dans le spectrophotomètre à 325 nm, Ce nombre est ensuite multiplié par ses' facteur de dilution, puis divisé par le coefficient d’extinction de 52 480, cela donnera un nombre en mM. Réaliser un stock de 100 mM (conserver à -20 ° ; C) et à partir de cette base, une aliquote de 10 mM est fabriquée, l’acide rétinoïque quotidien nécessaire serait de 5 ml de cette aliquote de 10 mM dans un milieu ALI de 995 ml. Exemple : la lecture de 325 nm est de 1,15. 1,15 x 10 000 (facteur de dilution) / 52 480 = 0,219 = 219 mM, en faire un stock de 100 mM, en éthanol absolu.
DMEM à haute teneur en glucose (1x), liquide, avec L-glutamine et pyruvate de sodiumGibco11995
Extrait hypophysaire bovinGibco13028-014Utilisé pour les milieux BEGM ALI.
NystatinSigmaN4014-50 mgPréparer une solution de 3,3 mg/ml.
Albumine sérique bovineFisher ScientificBP1600-100Préparez une solution de 10 mg/ml de solution dans de l’eau milliQ.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Il se présente sous la forme d’un kit composé d’un flacon de milieu et de flacons avec des suppléments. Pour plus de détails, voir ci-dessous.
Hydrocortisone StemCell7904Dissoudre 2,4 mg d’hydrocortisone dans 1 ml de jdH2O (utilisé pour fabriquer la solution mère d’hydrocortisone 200x)
Sel d’héparine sodique dans PBS (2 mg/ml)StemCell7980À utiliser.
Flacons filtrants (500 ml)Corning4310970.22 &mu ;
Tubes filtrants (50 ml)MilliporeSCGP00525Steriflip, 0.22 &mu ; Pointes de pipette de taille de pores
m - ART Barrier TipsMolecular Bioproducts2139RI, 2069RI, 2179RI
Tubes coniques, stériles, 15 ml et 50 ml
ddH2O, éthanol absolu, glace
CO2 centrifugeuse
réfrigérée
sécurité
(P2, P200, P1000), 9 po Pipettes
Gants
Blouse de laboratoire avec poignets étanches
<> < td>(ceci est stable pendant 2 semaines à 2-8 ° ; C ou jusqu’à 6 mois à -20 ° ; C)
Milieux et solutions utilisés : RecipeUtilisé pour
Remarque générale : réchauffez toujours le support à température ambiante
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Milieu d’application avec une aliquote d’acide rétinoïque
(mélangez-les moitié-moitié et filtrez)
  • 500 ml de milieu BEGM Lonza avec une aliquote de suppléments
< ul>
  • digestion de la biopsie
    • BEGM+ media
    • 50 ml BEGM media
    • cellules de maintien sur le plastique dans les plaques (passage0)
    • 10 &mu ; L Acide rétinoïque (solution de travail)
    • cellules d’ensemencement dans le ballon (passage1 ; partiellement)
    • maintenir les cellules dans le ballon
    BEGM++ media
    • 50 ml Lonza' s Milieux BEGM avec suppléments
    • ensemencement de cellules fraîches dans une plaque à 12 puits sur plastique
    • 1 ml de sodium BiCarb
    • Maintien des cellules dans les plaques sur plastique (passage0 ; seulement partiellement)
    • 2,5 ml NuSerum
    • ensemencement des cellules dans le ballon (passage1 ; partiellement)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Maintenir les cellules sur le transwell avant qu’elles ne deviennent ALI
    • 250 ml BEGM avec suppléments
    • 2 ml d’extrait hypophysaire bovin (solution à 12,5 mg/ml)
    • 1 ml de nystatine (solution à 3,3 mg/ml)
    • 75 &mu ; l BSA (solution à 10 mg/ml)
    200X Solution mère d’hydrocortisone (96 &mu ; l/ml solution)
    • 200 &mu ; l Hydrocortisone dissoute
    • En complément du milieu de base complet PneumaCult-ALI pour le dernier jour dans le flacon et lorsque les cellules sont sur des inserts
    • 4250 &mu ; l Chlorure de sodium dissous
    • 540 &mu ; l ddH2O
    • 10 &mu ; l éthanol absolu
    solution filtrante à travers 0,22 &mu ; m filtre, solution aliquote et stocker à -20 ° ; C, éviter les cycles de gel/dégel supplémentaires
    PneumaCult-ALI Milieu de base complet
    • 450 ml PneumaCult-ALI Milieu basal
    • Milieu de base pour les trois milieux PneumaCult-ALI
    • 50 ml PneumaCult 10x Supplément
    • Le support PneumaCult est sensible à la lumière, donc gardez-le toujours dans l’obscurité
    PneumaCult-ALI Maintenance MediumPer 1 ml de PneumaCult-ALI Complete Base Medium add :Culture ALI sur inserts
    • 10 &mu ; l PneumaCult 100x Maintenance Supplément
    • 2 &mu ; l Héparine (d’une solution mère à 2 mg/ml)
    • 5 &mu ; l Hydrocortisone (d’un 96 &mu ; l/ml solution mère)
    Applications des de laPipettes de biologiqueen verre

    Références

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