Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l'interface Air Liquide

Résumé

Cellules épithéliales nasales, obtenues par grattage superficiel de la biopsie des volontaires humains, sont expansées et transférées sur des inserts de culture tissulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules sont cultivées à l'interface air-liquide, ce qui donne des cultures de cellules ciliées et non ciliées. Cultures de cellules épithéliales nasales différenciées fournissent des modèles expérimentaux viables pour l'étude de la muqueuse respiratoire.

Résumé

Les modèles in vitro en utilisant des cellules epitheliales primaires humaines sont essentiels à la compréhension des fonctions principales de l'épithélium des voies respiratoires dans le cadre d'infections microbiennes ou des agents inhalés. Des comparaisons directes de cellules obtenues à partir de populations malades permettent de caractériser différents phénotypes et disséquer les mécanismes sous-jacents de médiation changements dans la fonction des cellules épithéliales. La culture de cellules épithéliales provenant de la région trachéo-bronchique humain a été bien documenté, mais est limitée par la disponibilité de tissu pulmonaire humain ou de caractère invasif associé à l'obtention de biopsies bronchiques les brosses. Cellules épithéliales nasales sont obtenus par biopsies superficielles nasale de gratter beaucoup moins invasives et les sujets peuvent être biopsiés plusieurs fois, sans effets secondaires importants. En outre, le nez est le point pour le système respiratoire d'entrée et donc l'un des premiers sites à être exposés à tout type de stress d'origine atmosphérique, tels que des agents microbiens, polluants ou allergènes.

Brièvement, les cellules épithéliales nasales obtenues à partir de volontaires humains sont expansés sur des plaques de culture revêtues de tissu, et ensuite transférés sur des inserts de culture cellulaire. Après avoir atteint la confluence, les cellules continuent à être cultivées à l'interface air-liquide (ALI), pendant plusieurs semaines, ce qui crée plus physiologiquement conditions pertinentes. La condition de culture ALI utilise des milieux définis menant à un épithélium différencié qui présente des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à l'épithélium nasal humain, avec des cellules ciliées, et la fois la production de mucus. des inserts de culture tissulaire avec des cellules épithéliales nasales différenciées peuvent être manipulées dans une variété de façons en fonction des questions de recherche (traitement avec des agents pharmacologiques, la transduction avec des vecteurs lentiviraux, l'exposition à des gaz ou de l'infection par des agents microbiens) et analysés pour de nombreux paramètres différents, allant de voies cellulaires et moléculaires, ch fonctionnelleanges, morphologie, etc

Dans les modèles in vitro de cellules épithéliales nasales humaines différenciées permettra aux enquêteurs de répondre roman et questions de recherche importantes en utilisant des modèles expérimentaux organotypiques que reproduire en grande partie de l'épithélium nasal in vivo.

Introduction

Objectif de la technique

Les cellules épithéliales (ECS) dans les voies respiratoires sont parmi les premiers sites à être directement exposés à des facteurs de stress environnementaux inhalés, comme les agents pathogènes, des allergènes ou polluants atmosphériques. CE sont plus un obstacle structurel: Ils agissent comme un standard pour initier et réguler la réponse immunitaire respiratoire ^1-3 par la libération de médiateurs solubles ^4-6 et l'expression de ligands / récepteurs sur leur surfactant ^7-9. Bien que des lignées de cellules immortalisées peuvent être utilisés comme modèles pour étudier les EC ....

Protocole

Une. Préparer plastique Ware: Manteau Plate

1. Ajouter 500 ul PureCol (1:100 dilué avec de l'eau stérile) dans chaque puits d'une plaque à 12 puits.
2. Incuber à 37 ° C dans un incubateur pendant 30 min, retirer le PureCol et rincer avec du HBSS juste avant les cellules sont ajoutées à la plaque (voir l'étape 3.1 ci-dessous).

2. L'obtention et le prétraitement de biopsie de CNE humain

1. Nasale gratter biopsie
   1. Obtenir EC superficielles qui tapissent les cornets nasaux sous vision directe à travers un spéculum réutilisable polypropylène nasale 9 mm (modèle 22009) sur un otoscope d'e....

Résultats

CNE cultivée en suivant le protocole décrit ici re-différencier en une couche hétérogène de EC composé de cellules ciliées et non ciliées, représentant la situation in vivo (Figure 1). Certains des CNE sont différenciées mucus de production (cellules colorées en bleu en utilisant AB / PAS, figure 1B). Même si le protocole présenté ici est optimisée, la différenciation peut varier en ce qui concerne la distribution des populations de cellules totales (c'est à dire l.......

Discussion

EC respiratoires fournissent non seulement une barrière physique pour protéger le corps humain de stimuli exogènes ^20, mais aussi agir comme un standard pour initier et réguler les réponses respiratoires de défense immunitaire ^1-3 via la sécrétion de médiateurs solubles ou des interactions cellule-cellule récepteur-ligand directs. Afin d'étudier le rôle des EC dans la réponse immunitaire, pour examiner les différences potentielles entre les EC des populations malades, ou pour étudier les effets.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Spéculum nasal	Welch Allyn	Modèle 22009	9 mm, polyproylène réutilisable
Otoscope de fonctionnement	Welch Allyn	Modèle 21700
Cuvette de cellule de sonde rhinocéros	Arlington Scientific	SY-96-092	pliez la tête de la cuvette un peu plus
Plaques de culture à 12 puits	Corning	3512
Inserts de culture cellulaire à membrane Transwell	Corning	3460
Fiole de culture tissulaire	Corning	430639 et 430641	T25 et T75
Milieu ventilé RPMI 1640 (avec L-Glutamine)	Gibco	11875
Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques/trachéales	cellules	511-500
BEGM Milieu de croissance des cellules épithéliales bronchiques	Lonza	CC-3170	Il s’agit d’un kit composé d’une bouteille de fluide et de flacons avec des suppléments.
Bicarbonate de sodium 7,5 % solution	Gibco	25080	Utiliser tel quel.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Utilisation telle quelle.
BAMBANKER Gel de milieu	BAMBANKER BAMBANKER	302-14681	Utiliser tel quel.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(récipient de congélation cellulaire sans alcool CryoPrep)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	diluer 1:100 avec de l’eau stérile (devrait être d’environ 0,03 mg/ml)utiliser 500 &mu ; l/puits d’une plaque HBSS à 12 puits
avec Ca2 et Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissoudre à 1,5 mg/ml, qui est une solution 100x, ajouter 10 &mu ; l à chaque ml de milieu
Trypsine, 0,25 %, 1x, avec rouge de phénol	Gibco	25200-056	Utilisation à l’inhibiteur
trypsine de soja (SBTI)	Sigma	T6522	Utilisation dissoute dans HBSS à une concentration de 1 mg/ml
Acide rétinoïque	Sigma	R7632	Compléter 100 &mu ; M solution mère (voir ci-dessous), diluer à 10 &mu ; M avec de l’alcool absolu, prendre 5 &mu ; l de ceci et ajoutez-le à un milieu BEGM de 1 ml (notre solution de travail). Le rétinol All-trans a un coefficient d’extinction de 52 480 dans l’éthanol à 325 nm. Dissoudre 25 mg dans 50 ml d’éthanol absolu. Des dilutions en série doivent être effectuées, diluer 50 ml de stock dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, et à nouveau prendre 50 ml de celui-ci, diluer dans 450 ml d’éthanol absolu, prendre 100 ml de celui-ci et diluer dans 900 ml d’éthanol absolu et lire dans le spectrophotomètre à 325 nm, Ce nombre est ensuite multiplié par ses' facteur de dilution, puis divisé par le coefficient d’extinction de 52 480, cela donnera un nombre en mM. Réaliser un stock de 100 mM (conserver à -20 ° ; C) et à partir de cette base, une aliquote de 10 mM est fabriquée, l’acide rétinoïque quotidien nécessaire serait de 5 ml de cette aliquote de 10 mM dans un milieu ALI de 995 ml. Exemple : la lecture de 325 nm est de 1,15. 1,15 x 10 000 (facteur de dilution) / 52 480 = 0,219 = 219 mM, en faire un stock de 100 mM, en éthanol absolu.
DMEM à haute teneur en glucose (1x), liquide, avec L-glutamine et pyruvate de sodium	Gibco	11995
Extrait hypophysaire bovin	Gibco	13028-014	Utilisé pour les milieux BEGM ALI.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Préparer une solution de 3,3 mg/ml.
Albumine sérique bovine	Fisher Scientific	BP1600-100	Préparez une solution de 10 mg/ml de solution dans de l’eau milliQ.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	Il se présente sous la forme d’un kit composé d’un flacon de milieu et de flacons avec des suppléments. Pour plus de détails, voir ci-dessous.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissoudre 2,4 mg d’hydrocortisone dans 1 ml de jdH2O (utilisé pour fabriquer la solution mère d’hydrocortisone 200x)
Sel d’héparine sodique dans PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	À utiliser.
Flacons filtrants (500 ml)	Corning	431097	0.22 &mu ;
Tubes filtrants (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 &mu ; Pointes de pipette de taille de pores
m - ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Tubes coniques, stériles, 15 ml et 50 ml
ddH2O, éthanol absolu, glace
CO2 centrifugeuse
réfrigérée
sécurité
(P2, P200, P1000), 9 po Pipettes
Gants
Blouse de laboratoire avec poignets étanches
<> < td>(ceci est stable pendant 2 semaines à 2-8 ° ; C ou jusqu’à 6 mois à -20 ° ; C) Milieux et solutions utilisés : Recipe Utilisé pour Remarque générale : réchauffez toujours le support à température ambiante BEGM media 500 ml BEGM Cell Milieu d’application avec une aliquote d’acide rétinoïque (mélangez-les moitié-moitié et filtrez) 500 ml de milieu BEGM Lonza avec une aliquote de suppléments < ul> digestion de la biopsie BEGM+ media 50 ml BEGM media cellules de maintien sur le plastique dans les plaques (passage0) 10 &mu ; L Acide rétinoïque (solution de travail) cellules d’ensemencement dans le ballon (passage1 ; partiellement) maintenir les cellules dans le ballon BEGM++ media 50 ml Lonza' s Milieux BEGM avec suppléments ensemencement de cellules fraîches dans une plaque à 12 puits sur plastique 1 ml de sodium BiCarb Maintien des cellules dans les plaques sur plastique (passage0 ; seulement partiellement) 2,5 ml NuSerum ensemencement des cellules dans le ballon (passage1 ; partiellement) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintenir les cellules sur le transwell avant qu’elles ne deviennent ALI 250 ml BEGM avec suppléments 2 ml d’extrait hypophysaire bovin (solution à 12,5 mg/ml) 1 ml de nystatine (solution à 3,3 mg/ml) 75 &mu ; l BSA (solution à 10 mg/ml) 200X Solution mère d’hydrocortisone (96 &mu ; l/ml solution) 200 &mu ; l Hydrocortisone dissoute En complément du milieu de base complet PneumaCult-ALI pour le dernier jour dans le flacon et lorsque les cellules sont sur des inserts 4250 &mu ; l Chlorure de sodium dissous 540 &mu ; l ddH2O 10 &mu ; l éthanol absolu solution filtrante à travers 0,22 &mu ; m filtre, solution aliquote et stocker à -20 ° ; C, éviter les cycles de gel/dégel supplémentaires PneumaCult-ALI Milieu de base complet 450 ml PneumaCult-ALI Milieu basal Milieu de base pour les trois milieux PneumaCult-ALI 50 ml PneumaCult 10x Supplément Le support PneumaCult est sensible à la lumière, donc gardez-le toujours dans l’obscurité PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml de PneumaCult-ALI Complete Base Medium add : Culture ALI sur inserts 10 &mu ; l PneumaCult 100x Maintenance Supplément 2 &mu ; l Héparine (d’une solution mère à 2 mg/ml) 5 &mu ; l Hydrocortisone (d’un 96 &mu ; l/ml solution mère)

Applications des de laPipettes de biologiqueen verre