Anticorps coloration dans C. Elegans Utilisation de «gel-Cracking"

Résumé

"Freeze-fissuration," une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Résumé

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. "Freeze-craquage" est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d'un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l'échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d'échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d'échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l'anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l'anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l'antigène d'intérêt.

Introduction

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières ^1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d'intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires son....

Protocole

NOTE: Plusieurs étapes du protocole sont présentés avec des options pour l'installation et la préparation en fonction des conditions spécifiques de l'expérience. Pour ces cas, des mesures alternatives sont présentées comme A, B, C, etc Le protocole de mesures alternatives est présenté dans la figure 1.

Une. Préparation des lames Polylysine filmés

Trois types de lames différentes peuvent être utilisées, selon le compromis souhaité entre la facilité de préparation, l'adhérence relative, et la liaison non spécifique de l'anticorps. Les détails des variantes de préparation d....

Résultats

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l'apparition anormalement ondulé de l' muscles dans les figures 3A-D.......

Discussion

Le protocole de congélation-craquage est l'un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C'est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l'étape 3). Tout d'abord, afin de ma.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
lame de poly-L-lysine (marque ESCO)	Fisher	12-545-78	Les lames de marque Sigma conviennent également au
bromhydrate de poly-L-lysine	Sigma	P1524	IMPORTANT : Marque et poids moléculaire élevé des lames critiques en polylysine
à bord unique givré	Fisher	48312-002	D’autres marques conviennent à
l’azoture de sodium	Sigma	S2002-25G	TOXIQUE, portez des gants et un masque tout en pesant la poudre pour faire 10 % de stock. Porter des gants lors de la tuyauterie
pot de coloration de la solution mère coplin	VWR	47751-792	D’autres marques conviennent
Enveloppe à 5 lames	Microscopie électronique Science	71549-01	L’une des nombreuses marques différentes de support de petites lames, adapté à la coloration
du paraformaldéhyde	VWR	MK262159	IMPORTANT : Les solutions de formol régulières (37 % de formaldéhyde) ne conviennent PAS. Soit 1) Dissoudre la paraformaldéhyde crysatlaline dans un tampon phosphate et stocker dans de petites aliquotes congelées. Ou 2) acheter du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique en aliquotes. TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.
Solution de glutaraldéhyde, 25 % dans l’eau	Sigma	G 5882	IMPORTANT : acheter du glutaraldéhyde de qualité microscopie électronique en ampoules ; TOXIQUE -porter des gants ; Jetez l’excédent dans l’évier avec de l’eau.
Triton X-100	VWR	EM-9410	D’autres marques conviennent
Sérum de bovin Albumine	Fisher	ICN820451	D’autres marques conviennent
Sérum d’âne, lyophilisé	Jackson Immunoresearch	017-000-121	D’autres marques conviennent
Cy3 Donkey anti-Souris IgG multi-marquage	Jackson Immunoresearch	715-165-150	Cette société est recommandée pour ses anticorps multi-marqueurs de haute qualité (appauvris en affinité). Sélectionnez le colorant et l’antigène appropriés (animal utilisé pour produire l’anticorps primaire).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	D’autres marques conviennent DAPI
, 4',6'-diamidino-2-phénylindole	dichlorhydrate Sigma	D 9542	TOXIQUE. Portez des gants et distribuez en petites aliquotes et feeze pour minimiser l’exposition
Whatman #1 Filtres de 15 cm de diamètre	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 l’épaisseur est optiquement la meilleure
Chemise de lames de microscope	VWR	48429-092	D’autres marques conviennent