Summary
Een voorbeeld van een nano geneesmiddel op basis polymalic zuur gepresenteerd naar het rationele ontwerp van gepersonaliseerde geneeskunde die voor kanker. Het beschrijft de synthese van een nano geneesmiddel Her2-positieve menselijke borst kanker in naakt muizen.
Introduction
In het post-genoom tijdperk waarin genoom van kanker zijn ontrafeld (National Center for Biotechnology en The Cancer Genome Atlas), de toekomstige behandeling van kanker zal goed zijn voor de genetische diversiteit van tumoren vaak binnen dezelfde tumor 1-4. Bioinformatica en snel, niet duur DNA-sequencing maakt overname van kwaadaardige genen / mutaties op een persoonlijk niveau 2,4,5. Zodra de genen zijn geïdentificeerd, zullen patiënten worden behandeld met gepersonaliseerde geneeskunde te wijzigen of zwijgen hun expressie van kwaadaardige genen 6. De noodzaak om kankercellen en leveren drugs in deze cellen dringt polyfunctionele afgiftesystemen. Uiteraard kan nano drugs voldoen aan deze eis 7.
In een stijgende golf van ontdekkingen nanodeeltjes hebben bewezen geschikt ladingen van chemotherapeutische geneesmiddelen, proteïnen en / of genetisch actieve materiaal kankercellen brengen. Echter, bijwerkingen blijven advertentie zijngekleed. Een daarvan betrekking tot de afwezigheid van biologische afbreekbaarheid kan afzetting van materiaal veroorzaken bij gezonde weefsels en organen met de kans op ziekten veroorzaken. Om afzetting minimaliseren, worden niet-toxisch en niet-immunogeen polymalic zuur dat van microbiële oorsprong en biologisch afbreekbaar H2O en CO2 8 ingevoerd. We maken gebruik van het polymeer tot een all-in-een covalente type nano drug synthetiseren. Het bevat chemisch verbonden chemotherapeutica zoals Temozolomide, doxorubicine, of antisense oligonucleotiden en functionele groepen serveren extravasatie weefsel targeting, endosomolytisch levering. De drugs zijn intrinsiek afgesplitst van de nano-platform toen ze aankwamen in de beoogde tumorcel, waardoor hun volledige farmaceutische activiteiten regenereren.
We beschrijven de werkwijze van microbiële productie van het polymeer nano platform, de zuivering en de chemische synthese van een nano geneesmiddel dat Trastuzumab (Herceptin) bevat voor kankertargeting en een antisense oligonucleotide voor de remming van HER2 overproductie. Bij de toepassing van de nano drug xenogeen menselijk HER2-positieve borstkanker op naakt muizen, tonen we aan hoge effectiviteit van de behandeling van kanker. De beginselen van tumor targeting en gen silencing hier geïntroduceerd polymalic zuur nano geneesmiddelen kunnen worden toegepast bij de behandeling van andere gevallen van kanker.
Protocol
Alle experimenten voldoen aan de officiële dier voorschriften, waaronder chirurgische en niet-chirurgische ingrepen uitgevoerd in vivo en in volledige overeenstemming met IACUC protocollen.
1. Bioproductie van polymalic Acid
- Groeien een entkweek van bolletjes op agar en breng plasmodia tot 100 ml kweekmedium met een 25 ° C thermo verklaarde incubator en basale kweekmedium 8,9.
- Produceren een hoeveelheid zwaartekracht gepakt 500 ml micro plasmodia onder uitsluiting van licht om sporulatie voorkomen.
- Bereid 80 g CaCO 3 gesuspendeerd in 8 L basaal medium in 10 L bioreactorvat. Breng 500 ml verpakt micro plasmodia in het reactievat geplaatst en laat de Bioprocess gedurende 75 uur bij 25 ° C, 10 L / min stroom van gefilterde lucht en 150 rpm geroerd met een roerder segment.
- Beëindigen wanneer de cultuur bouillon heeft pH 4,8 die het einde van de productie van PMLA en PMLA inhoud door t metenhij hydroxamaat / Fe (III) assay.
- Koel de bouillon tot 17 ° C en laat de cellen om zich te vestigen door de zwaartekracht.
- Koel af tot 4 ° C en op pH 7,5, 2 M NaOH gebruiken. Pomp de bovenstaande vloeistof door een kolom gevuld met 1,5 liter DEAE-cellulose richting beneden naar boven (grove korrel DEAE, geëquilibreerd met 20 mM Tris-HCl pH 7,5 bij 5 ° C).
- Wassen met 3 kolommen buffer die 0,3 M NaCl na richtingsverandering van boven naar beneden en elueer PMLA in aanwezigheid van 0,7 M NaCl.
- Pas tot 0,1 M CaCl2 en neerslaan PMLA-Calcium met 80% ijskoude ethanol. Fractioneren op Sephadex G25 in PMLA-calcium van 80-300 kDa, 50-80 kDa en 10-50 kDa, met water in afwezigheid van buffer en zout.
- Ga elke fractie via een Amberlite IR 120 H + kolom onmiddellijk bevriezen de doorstroming polymalic zuur in vloeibare stikstof voor lyofilisatie.
- Oplossen in droge aceton. Na filtratie verwijderen oplosmiddelin droge luchtstroom, Lyophilize en bewaar bij -20 ° C.
2. Synthese van polymalic Acid-based Nano Drug
- Activeer carboxylgroepen van PMLA (P) door het mengen van 116 mg (1 mmol malyl eenheden) PMLA-H in 1 ml watervrij aceton en 1 mmol N-hydroxysuccinimide en 1 mmol dicyclohexyl carbodiimide in 2 ml dimethylformamide (DMF). Roer bij 20 ° C gedurende 3 uur. Voeg 0,05 mmol 5000 mPEG-NH2 (0,05 mol% van malyl eenheden) in 1 ml DMF gevolgd door 0,05 mmol triethylamine (TEA).
- Druppelsgewijs opgelost in DMF 0,4 mmol leucine-ethylester (Loet) (40 mol% eenheden van malyl), voeg 0,1 mmol 2-thiol-1-ethylamine (2-MEA) (10 mol% eenheden malyl) en 0,5 mmol TEA, alle opgelost in DMF. Na elke toevoeging, laat 1 uur en controleren op voltooiing van de reactie door negatieve ninhydrine reactie (dunne laag-chromatografie, TLC).
- Verwijder overgebleven NHS-ester door spontane hydrolyse met fosfaat gebufferde zoutoplossing (30 min, pH 6.8). Ontzouten dan PD-10 Kolom, te verkrijgen "preconjugate" als een wit poeder door vriesdrogen. Sla droog bij min 20 ° C.
- Los 30 mg antilichaam (mAb, IgG2a-κ) in 4,5 ml 100 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 5,5.
- Verminder disulfidebindingen met 5 mM tris (2-carboxy-ethyl) fosfine hydrochloride gedurende 30 min bij 20 ° C en zuiveren op PD-10 kolom.
- Los Mal-PEG 3400-Mal in 2 ml van dezelfde buffer en voeg de gereduceerde mAb eindvolume van 10 ml en roer overnacht bij 4 ° C. Concentreer tot 2,5 ml meer dan Vivaspin 20, uitsluiting 30 kD, en zuiveren dan Sephadex G75. Controleer product over sec-HPLC en meet hoeveelheid fotometrisch bij 280 nm golflengte.
- Bevestig Mal-PEG-Mal-mAb aan "preconjugate" thiolen verkrijging P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Doe dit door het mengen van 5 ml van 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal tot 50 mg (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) in de bovenstaande pH 5,5, passen concentratie van sulfhyDryl 2 mM en incubeer bij 20 ° C gedurende 3 uur (opbrengst 98%).
- Oplosbaar 3'-H2N-AON in DMF / PBS (pH 7,2) en reageren met N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionaat (SPDP) in (1:1 v / v) DMF / methanol (ninhydrinetest ) en zuiveren AON-PDP gedurende Sephadex-LH20 in methanol, daarna in water en Lyophilize.
- Incubate 800 nmol geactiveerd AONs in de 5,5 pH-buffer met de hierboven bereide Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate overnachting tot de disulfide uitwisseling reactie wordt beëindigd.
- Nemen fluorescerende Alexa Fluor 680-maleïmide vormende thioether met polymeer-2-MEA-SH. Blokkeren overtollige sulfhydryls met 3-pyridyldithio-propionaat (PDP) en zuiveren dan Sephadex G75. Bewaren bij 4 ° C of snap bij -80 ° C ingevroren tot verder gebruik.
3. Testen en Eigenschappen
- Voer tests voor zuiverheid en stabiliteit in PBS en serum bij 4 ° C en 37 ° C door sec-HPLC-analyse. Gebruik polystyreen sulfonaat als Molecular gewicht normen. Meet nano grootteverdeling en zeta-potentials. Gebruik commerciële systemen.
- Aan 320 pi monster 160 ui 10% (w / v) hydroxylammoniumchloride en 160 ui 10% (w / v) NaOH. Na 10-15 min mengen met 160 ul van 5% (w / v) Fe (III) Cl3 in 12% (v / v) HCl en lees Een 540 van hydroxamaat / Fe (III). Bereken PMLA uitgaande 1 mg / ml PMLA overeen met 2,5 A 540.
- Hydrolyseren de nano geneesmiddel overnacht in 2 M HCl bij 110 ° C en bepaling appelzuur aan omgekeerde fase chromatografie onder verwijzing naar voorbeelden verrijkt met appelzuur normen. Klieven nano drug met 100 mM dithiothreitol en meet Morfolino-AON door kwantitatieve omgekeerde fase HPLC tegen Morfolino AON normen.
- Neem nano drug zonder decollete en meet antilichamen met behulp van een eiwitassaykit. Kwantificeren mPEG doordat zijn reactie met ammonium ferrothiocyanate, dan uitpakken met chloroform en lees absorptie bij 510 nm golflengte 10
- Voer ELISA met 5 pi van nano drug (1-10 ug mAb) per well testen antilichaam activiteit en colligation. Gebruik 0,5 ug / goed transferrinereceptor en HER2, respectievelijk, in-gecoat antigenen en-peroxidase gekoppelde secundaire antilichamen.
- Bereken bereikt% voor AON, MPEG en mAb met betrekking tot appelzuur (100%) en vergelijken met de% door de constructie is (zie voorbeelden tabel 1 en tabel 2).
4. In vitro testen
- Incubeer de nano geneesmiddel met gekweekte kankercellen en meten overlevende cellen tijd hun activiteit geel reagens [3 verminderen - (4,5-dimethyl-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyfenyl) -2 - (4-sulfofenyl )-2H-tetrazolium, inwendig zout] (MTS) een blauwe kleurstof en lees elkaar verschillen met een fotometer. Volg de instructies van de kit leverancier.
- Bereid cel extracten in vitro of ex vivo voor Western blotting. Gebruik ijskoude extractie buffer dat SDS en proteaseremmercocktail bevat. Afzonderlijke eiwitten door reducerende SDS-polyacrylamide gelelektroforese.
- Doe western blotting voor eiwitten van belang in het monster extracten. Gebruik secundaire antilichamen geconjugeerd aan alkalische fosfatase.
- Gebruik confocale microscopie naar cel opname en co-lokalisatie van nano drug polymeer platform, AON en endosomes demonstreren met behulp van fluorescentie labeling. Bevestig Alexa Fluor 680 tot de nano conjugaat platform en Lissamine te AONs als fluorescentie labels. Gebruik een microscoop 5X spectrale scanner en levende kankercellen de verdeling van de gemerkte moleculen visualiseren
- Vlek endosoom membranen met styryl Rode fluorescerende kleurstof en demonstreren endosoom colocalization of release.
5. In vivo testen
- Bereid de menselijke HER2-positieve borstkanker muismodel (naakt muis Tac: Cr: (MCr)-Foxnnm). Plaats een 0,72 mg 17β-estradiol releasing pellet (90-dagen versie) subcutaneously in de hals van elke muis.
- Injecteren dan 1 x 10 7 BT-474 tumorcellen subcutaan in de rechter flank en laat de tumor groeien.
- Start regeling bij tumoren 120 mm3 in grootte door injectie in de staartader 150 ul nano conjugaat dat 2,5 mg / kg AON en / of 4,5 mg / kg van elk antilichaam. Voor de behandeling injecteren tweemaal per week, totaal zes keer.
- Meet tumorgrootte met calipers tweemaal de zwakke en moet berekenen met de formule (lengte x diepte x breedte) x (π / 6). Euthanize dieren 2 weken na de laatste injectie en na sedatie met een oplossing van ketamine en dexmedetomidine gevolgd door cervicale dislocatie.
- Isoleer tumoren en vlek secties met H & E voor morfologische evaluatie.
- Voor de beoordeling van de distributie van medicijnen op een dier schaal, gebruik dan een fluorescentie imaging systeem. Spuit de Alexa Fluor 680 gelabeld nano drug en imago bij 24 en 48 uur.
- Euthanaseren van de dieren en detecteren de fluorEscence in geïsoleerde en doorbloede tumoren en organen.
Representative Results
Inhibitie van HER2-positieve borstkanker door silencing HER2 receptor expressie en het blokkeren van HER2-signalering 12
Strategie
Tussen de verschillende vormen van menselijke borstkanker, HER2-positieve tumoren hebben de slechtste klinische uitkomst. We presenteren de succesvolle behandeling van mens-overexpressie van HER2 borstkanker in de naakt muismodel. De strategie omvat de nano geneesmiddel actief in zowel de onmiddellijke uitschakeling van de HER2 signaalweg gebruik Herceptin en HER2-specifieke AON voor het blokkeren van de HER2-mRNA afhankelijke synthese van de receptor (Figuur 1). De lead nano conjugaat Herceptin en anti-HER2 AON bevat wordt getoond in figuur 3 met twee controles die zonder ofwel Herceptin of AON zijn. De lead compound bevatte anti-MsTfRmAb actieve extravasatie bereiken door transcytose doorgaandugh binding aan TfR van de tumor bloedvaten endotheel. Veel minder opname in de tumor werd vastgesteld in de afwezigheid van het antilichaam en werd toegeschreven aan tumor afhankelijk EPR effect 13. Fluorescerende versies van de nano conjugaten die Alexa Fluor 680 werden gesynthetiseerd voor imaging studies.
. Figuur 1 Mechanisme van AON levering in HER2-positieve borstkanker cellen en tumorgroeiremming Linksboven:. Nano conjugaat aangepast van figuur 3. Linksonder: Muis tumorvaten uitdrukken TfR op het oppervlak. De nano geneesmiddel bindt aan de receptor en in de tumor door transcytose. Bovendien zekere mate van toegang tot de tumor kan door het ongeordende endotheliale lagen die aan tumor afhankelijke verhoogde opname en retention (EPR) 13. Vervolgens de nanodrug bindt aan HER2 expressie op menselijke kankercellen en internaliseert in vroege endosomen. Binding blokkeert ook HER2 signaalweg. Na rijping van endosomen en de verzuring is de endosomale ontsnapping mechanisme van de nano geneesmiddel geactiveerd. Nanodrug die het cytoplasma vrijkomt uit de nano platform door reductieve klieving van de disulfide spacer en bindt aan HER2-mRNA blokkeert HER2-synthese. Blokkering van de synthese breidt blokkeren van HER2-signalering en induceert tumorgroeiremming.
Microbiële productie van de polymalic zuur platform
De nano conjugaat platform polymalic zuur (PMLA), geproduceerd door gecultiveerde microplasmodia van Physarum polycephalum en gezuiverd uit de bouillon zoals beschreven in het protocol en in figuur 2. Productie en zuivering waren glad en reproduceerbaar. Het was belangrijk om cont rol tijd, pH en temperatuur spontane splitsing van het polymeer te vermijden. Voorzichtig wassen en elutie van de DEAE-kolom wordt aanbevolen om DNA, koolhydraten, toxinen en gekleurde materiaal te verwijderen. Extreme zuiverheid werd verkregen na oplossing in watervrije aceton en eventueel onoplosbaar materiaal. Totaal bedrag van de geproduceerde PMLA was 5 ± 1 g per campagne. Bedragen van 1,5 ± 0,5 g sterk gezuiverde PMPLA van Mw 80.000-100.000 werden reproduceerbaar bereikt bij het gebruik van de 10 L bioreactor. Sec-HPLC elutieprofielen waren symmetrisch. Dynamische lichtverstrooiing analyse afhankelijk van het aantal distributie aangegeven een enkele piek die overeenkomt met een hydrodynamische diameter van 8 ± 1 nm en een polydispersiteitsindex van PDI = 0.10 ± 0.02, berekend door het instrument software voor veronderstelde bolvormige deeltjes. Zeta-potentieel was -22 ± 2 mV (pH 7,5).
/ 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2. Productie en zuivering van polymalic zuur uit gekweekte micro plasmodia van Physarum polycephalum (aangepast van Lee et al.. 9). Polymalic zuur (PMLA) wordt geproduceerd uit plasmodia van Physarum polycephalum in een bioreactor en verzameld uit de kweeksupernatant door binding op anionwisselaar (DEAE). Het elutiemiddel ethanol-geprecipiteerd als calciumzout. Oplossingen van het calciumzout zijn Mw-gefractioneerd op Sephadex-G25. PMLA bevattende fracties worden omgezet van de Ca-zout in het zuur dan Amberlite IR-120H +. De gratis PMLA wordt tenslotte gevriesdroogd om droge witte poeder.
Chemische synthese van het lood nano conjugaat
P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a nti-MsTfRmAb (0,2%)
De schematische structuur van de nano lood geneesmiddel en twee precursor nano conjugaten worden getoond in figuur ure 3. De lead bevat alle bestanddelen, terwijl de voorlopers werden ontworpen om ofwel AON HER2 of het antilichaam Herceptin missen. Naast AON en mAbs, de verbindingen die polyethyleenglycol, mPEG 5000 tot binding aan plasmaproteïnen minimaliseren speling door de reticulo-endotheliale systeem (RES) en degradatie door enzymatische splitsing. De antisense sequentie 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'was een aanvulling op Her2 mRNA en is zorgvuldig getest in vitro op verschillende-HER2 uitdrukken cellijnen te hoge specificiteit te verkrijgen in de richting van het blokkeren van HER2 synthese en niet tonen van off-target effecten.
8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Nano conjugeert menselijke HER2-positieve borstkanker te behandelen. Toonaangevende nano drug (topstructuur) bevat twee geneesmiddelen (Herceptin, AON HER2). Versies 2 en 3 bevatten slechts een van de geneesmiddelen. Opname van 1 en 2 in humane HER2-overexpressie tumorcellen wordt beheerd door de binding van Herceptin. Nano conjugaat 3, die Herceptin bevat ontving anti-HuTfRmAb voor endosoom opname door de menselijke cellen. De vervoeging met Alexa Fluor 680 was optioneel voor imaging doeleinden. De rode balk geeft de nano conjugaat platform PMLA / Loet (40%). % Geeft de fractie van appelzuur residuen verbruikt binding van het ligand aangegeven (totaal appelzuur residuen in de nanodrug = 100%).
Figuur 4. Chemische synthese van nanoconjugaten P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Van boven naar beneden:. Synthese van PMLA-N-hydroxy succinimidylester (PMLA-NHS) van hanger carboxylaten (chemische activering). Vervanging van de NHS door amide formatie met 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), methyl-PEG 5000-amine (MPEG 5000-NH 2), trileucine (LLL) of leucine ethylester (Loet). Deze "preconjugate" hecht mAb-Mal-PEG-Mal door thioether vorming en AON door de vorming van splitsbare disulfidebindingen. Leftover 2-MEA wordt afgetopt vormen amidoethyl-dithio-propionzuur. Slechts bevestiging van een mAb weergegeven. Meerdere bijlagen worden beheerd met behulp van mengsels van mAbs. Percentage% duidt fracties van carbonaten gebonden aan verschillende liganden (100% gratis PMLA).
De nano conjugaten werden gesynthetiseerd zoals beschreven in figuur ure 4. Het berekende molecuulgewicht van het loodconjugaat was 719.000. De totale opbrengst van de synthese was 45 ± 5% met betrekking tot het appelzuur inhoud. Gemiddeld van de 862 malyl eenheden (= 100%) van de 100 kDa PMLA platform 40% uitgevoerd Loet, 5% mPEG, 2% AON 2%, 0,2% en 0,2% Herceptin anti-MsTfR mAb. Het bedrag voor elk antilichaam overeen met een gemiddelde van 1,7 moleculen per molecuul PMLA platform. Het% ontworpen en het% gecontroleerd door de groep analyse waren hetzelfde binnen ± 5%. Een voorbeeld is het geval in tabel 1 voor de berekening van de experimentele inhoud appelzuur, AON, mAb en mPEG 5000 en tabel 2 toont de vergelijking van het gehalte in ontwerp. De hoge zuiverheid volgens de criteria in deel 3 werd gerealiseerd op basis van hoge reactiesnelheid opbrengsten en efficiënte scheiding op grootte uitsluiting (bv. gratis mAb en mAb-nanoconjugate worden gescheiden door 1 min op sec-HPLC), en selectieve oplosbaarheid in oplosmiddelen. De activiteit van monoklonale antilichamen is Geen van de in nano drug synthese te behouden, en het werd bevestigd dat de twee soorten antilichamen werden gemonteerd op hetzelfde polymeer platform. Het resultaat van atypische ELISA experiment wordt getoond in figuur ure 5. In het algemeen assays voor kwantitatieve groepsanalyses voor appelzuur, AON, eiwitten, PEG en ELISA waren robuuste, waardoor reproduceerbare resultaten wanneer uitgevoerd door verschillende personen en instrumentatie niet alleen bij de gerapporteerde synthese, maar ook wanneer gebruikt voor analyse andere gesynthetiseerde Nanoconjugates.
Tabel 1. Berekening van nanodrug samenstelling met betrekking tot appelzuur inhoud.
668table2.jpg "width =" 600 "/>
Tabel 2. Vergelijking van experimentele nano drug samenstelling met ontworpen compositie.
Figuur 5. ELISA voor de meting van antilichaamaffiniteit na chemische synthese, en voor het aantonen van binding van meerdere verschillende antilichamen. De nano geneesmiddel bevat antilichaam mAb (A) en antilichaam mAb (B) tegen antigenen A en B, respectievelijk. ELISA platen gecoat met antigen (A). Gratis mAb (A), gratis mAb (B), en nano drug worden toegepast op ELISA-platen. Na wassen worden de antilichamen getest met peroxidase gekoppelde secundaire antilichamen specifiek voor zowel mAb (A) of mAb (B), terwijl slechts mAb (A) is gebonden aan antigeen (A). Het is gezien dat gratis nano geneesmiddel geconjugeerd met mAb (A) en indirect geconjugeerd mAb (B) van dezelfde nano geneesmiddel molecuul, maar niet gratis mAb (B), Worden op de plaat vastgehouden. De concentratie afhankelijkheid toont vergelijkbare bindingsaffiniteiten voor vrije en geconjugeerde mAb (A), wat aangeeft dat de chemische vervoeging had geen invloed op antilichaam bindende activiteit. Bovendien is de co-ligatie van mAb (B) met mAb (A) op dezelfde fysieke entiteit (nano-platform) resulteert in antilichaam mAb (B) detectie. De hier getoonde experimentele resultaten hebben betrekking op anti-humaan TfRmAb (A) en anti-muis TfRmAb (B). Soortgelijke resultaten werden aangetoond voor andere antilichaam geteste stellen zoals anti-MsTfR mAb en anti-HER2 mAb (Herceptin).
De fysisch onderzoek bleek hydrodynamische diameter van 22,1 ± 2,3 nm voor P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (lood, de twee- drug-versie), 20,1 ± 2,4 nm voor P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (de AON drug versie) en 15,1 ± 1,2 nm voor P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0.2%) (Herceptin geneesmiddel versie). Zeta-potentialen bij pH 70,5 waren in deze volgorde -5,2 ± 0,4 mV, -5,7 ± 0,6 mV, en -4,1 ± 0,4 mV. Er zij vermeld dat de gemeten hydrodynamische diameter van nano conjugaten niet volgen additief de diameters gemeten gratis componenten.
Levering van nano geneesmiddel door de tumor celmembraan en vrij in het cytoplasma na 0 uur en 3h r
De levering van nano geneesmiddel door het celmembraan door endosomale opname wordt getoond in figuur ure 6 na 0 uur en 3 uur. Fluorescentie etiketten zijn aangebracht op de nano drug platform (Alexa Fluor 680, groen) en AON (Lissamine, rood) bevestigd. De superpositie wordt getoond in panelen D & L en samen met fluorescentie gelabelde endosomen (blauw) in panelen G & O. Pearson's correlatiecoëfficiënten (R (r) werden berekend op basis van de beelden met betrekking tot co-lokalisatie van platform / endosomes, AON / endosomes, platform / AON voor 0 uur en 3 uur. Thij 3 afbeelding hr aangegeven vrijlating uit endosomes in het cytoplasma en dissociatie van AON van de nano geneesmiddel door glutathion-afhankelijke disulfide splitsing in het cytoplasma.
Figuur 6. Confocale microscopie nano conjugaat opname door doelcellen (aangepast van Ding et al.. 11). Cellen werden gedurende 30 minuten bij 37 ° C met nano drug die dubbel waren gelabeld met Alexa Fluor 680 (groen) en het polymeer platform en met Lissamine (rood) die aan AON. Daarnaast werden endosomes gekleurd met FM1-43 (blauw). Lokalisatie wordt getoond na 0 uur (A) en 3 uur (B) incubatie. Panelen A, AB, & B, ij toon kleuring door de nano conjugaat fluoroforen alleen, enhun co-lokalisatie in A, cd & B, kl. Daarnaast is kleuring van endosomes getoond in panelen A, E & B, m en de colocalization van nano conjugaat en endosomesin panelen A, fg & B, nee. Panelen A, H & B, blz. tonen fase contrast voor desbetreffende panelen. (C) Pearson's correlatiecoëfficiënten R (r) voor de colocalization van platform-endosomes, AON-endosomes, platform-AON berekend voor 0 uur en 3 uur. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Remming van menselijke borstkanker in vitro en in vivo
In vitro groeiremming van HER2-overexpressie cellijn BT-474 in comvergelijking met lage expressie cellijn MDA-MB-231 is getoond in figuur ure 7. Mate van remming 50% en 30%, respectievelijk, door de leiding nano conjugaat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Remming van de andere verbindingen minder maar hoger voor BT-474 dan bij MDA-MB-231-cellen. BT-474 cellijn werd gekozen voor de behandeling van xenogene borstkanker muis.
Figuur 7. In vitro groeiremming van HER2 overexpressie BT-474 borstkankercellen en lage uitdrukken MDA-MB-231-cellen (aangepast van Inoue et al.. 12). Vergelijking van groeiremming voor overexpressie van HER2 BT-474 borstkanker cellijn ( links) en HER2 lage uiten borstkanker cellijn MDA-MB-231 (rechts). TfR (s) staat voor anti-MsTfRmAb en TfR (Hu / mevrouw) geeft anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. De lead nano drug, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TfR (Ms), en nano drugs verstoken van zowel Herceptin of AON HER2 worden vergeleken met PBS, Herceptin en AON HER2. Aangezien Herceptin, werd anti-MsTfRmAb geconjugeerd aan endosomale opname leggen door de tumorcellen. De concentraties waren 40 ug / ml met betrekking tot antilichamen, 4 uM met betrekking tot AON HER2, 4 uM endoporter (toepassing van AON). Belang aangeduid met *, P <0,05: ** p <0,02 *** p <0,003 vergeleken met PBS.
De resultaten van in vivo behandeling in Figuur 8 gepresenteerd voor muizen met BT-474 HER2 overexpressie menselijke borstkanker. De groei werd geremd> 95% van het lood nanodrug met Herceptin en HER2-specifieke AON in vergelijking met controles alleen behandeld met PBS (afb. ure 8). Remmingwas 60% of minder met Herceptin alleen, P / MPEG / Loet / Herceptin of P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot analyse van tumorextracten toonde remming van zowel HER2 synthese en Akt, maar geen verandering van totaal Akt en huishoudelijk enzym GAPDH. PARP gesplitst in overeenstemming met een verhoogd niveau van apoptose. Afbeeldingen van tumor na behandeling en weefselcoupes gekleurd met H & E illustreren tumorregressie worden in Fig ure 9.
Figuur 8. Tumorgrootte en eiwitten tijdens de behandeling met lood en voorloper nano drugs (aangepast van Inoue et al.. 12). Een. Tumor grootte voor de verschillende behandelingen (dag 21 tot dag 42, totaal 8 injecties). Balken geven de standaardafwijkingen van het gemiddelde. De lead geconjugeerd met anti-Her2 AON en Herceptin was superieur aan ofwel Herceptin alleen of enkele drug die nano conjugaten. B. Effect van de verschillende behandelingen op de expressie van HER2, gefosforyleerd Akt, totaal Akt, PARB, gesplitst PARB en GAPDH worden getoond door western blotting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9. Behandeling van HER2-positieve BT-474 menselijke borstkanker op naakt muizen. Tumorregressie en necrose / apoptose in weefsel secties (aangepast van Ionue et al.. 12). Boven: Krimp van de tumor (rode pijlen). Vermelding van het oestrogeen pellet om de tumorgroei (blauwe pijl) ondersteunen. Lower: hematoxiline en Eosine (H & E) kleuring van tumorsecties. Prolifererende tumor wordt getoond door de dichte pakking van tumorcellen. Necrotisch weefsel wordt gezien waar tumorcellen zijn geëlimineerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
De experimentele route voor de bereiding van nano medicatie een biologisch afbreekbare natuurlijke polymeer wordt voorgesteld dat kan worden gebruikt bij de synthese van gepersonaliseerde geneeskunde. De beschrijving begint met de gecontroleerde productie en zuivering van polymalic zuur, dat een veelzijdig platform voor nano drug synthese. Met reproduceerbare technieken, wordt het polymeer verkregen met een hoog molecuulgewicht en in extreme zuiverheid geschikt voor farmaceutisch syntheses. De synthese wordt beschreven voor een nano geneesmiddel dat wordt efficiënt behandelen HER2-positieve borstkanker. De beschrijving kan worden omgezet in synthese van de meeste andere nano geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Targeting omvat antilichamen zoals Herceptin dat een tumor specifiek antigeen zoals HER2 eiwit of andere tumor marker die efficiënt geïnternaliseerd binden. De nano drug levert een selectie van antisense oligonucleotiden en chemotherapeutica die efficiënt zal remmen de groei van de kanker onder treatment. In het voorbeeld Herceptin binding aan HER2 en specifieke antisense oligonucleotide hybridisatie met HER2-coderende mRNA resulteerde in langdurige blokkering van HER2-signalering en ernstige vermindering van HER2-positieve borstkanker. Op basis van het onderliggende principe van de tumor targeting en inhibitie van genexpressie door antisense oligonucleotiden hebben we to-date gesynthetiseerd diverse andere nano drugs en succesvol geremd preklinische menselijke glioblastoma en triple negatieve borstkanker 11,14-18.
De synthetische werk begint met de bereiding van zeer gezuiverde nano drug platform, dat is polymalic zuur uit de kweeksupernatant van Physarum polycephalum (een soort van de "slijmzwam" familie). De bereiding wijst op hoge molecuulgewicht van het polymeer, in beginsel waardoor hechting van talrijke antilichamen, peptiden, oligonucleotiden en andere moleculen functioneren in actieve geneesmiddelafgifte en tumor groeiremming. Following gecontroleerde kweken en zuiveren, heeft reproduceerbare kwaliteit polymeer in voorspelbare opbrengsten geproduceerd. Het polymeer wordt onder geschikte omstandigheden voor elk moment.
De synthese van PMLA nano conjugaten startend met de activatie van het polymeer-hanger carboxylaten wordt uitgevoerd in een enkele synthetische stappen uitgevoerd. Tussen stappen synthese kan desgewenst de wacht waardoor bereiding van willekeurige hoeveelheden tussenproducten gebracht en kan dus worden gebruikt opschaling. De voortgang van synthese wordt gevolgd met TLC en sec-HPLC, en zowel de samenstelling en werking van de nano geneesmiddel wordt geregeld door groep-specifieke kwantitatieve chemische analyses, ELISA en een verscheidenheid van fysieke metingen. Onze ervaring is dat deze syntheses zijn soepel en reproduceerbaar zijn gevorderd met uitstekende opbrengst en zuiverheid. Door te kiezen voor de specificiteit van antilichaam en antisense oligonucleotiden elke variant van nano drug is gunstig gesynthetiseerd als nodig is in personalized geneeskunde.
De modaliteiten van de succesvolle behandeling van menselijke HER2-positieve borstkanker zijn geldig vertegenwoordigers voor de voorbereiding van de muis kanker modellen, toepassing van nano drugs, beeldvorming en analyse van tumorgroei. De resultaten van in vitro levensvatbaarheid testen zijn bruikbaar bij het selecteren van de cellijn en de belangrijkste geneesmiddel voor gebruik in de dierproef. In vivo beeldvorming Xenogen bevestigt dat de nano geneesmiddel daadwerkelijk in de tumor wordt afgeleverd. Resultaten van western blotting onthult of het niveau van bepaalde eiwitten reageerden in de voorspelde mode tijdens de behandeling van kanker. Meting van tumorgrootte informeert over het succes van de behandeling, dat wil zeggen ongeveer inhibitie, recessie of regressie. De beschreven voorbeeld weerspiegelt onze ervaring met andere polymalic-zuur nanobouwstenen drugs wijst op een hoge mate van voorspelbaarheid, reproduceerbaarheid en de afwezigheid van opvallende toxiciteit. Recente resultaten over de toxiciteit en werkzaamheid van meervoudige targeted polymalic zuur conjugaten voor triple negatieve borstkanker behandeling in sterke steun van dit begrip 18. Een belangrijk kenmerk is dat onze nano drug is in staat om bio-barrières doordringen: de endotheliale barrière door extravasatie in de tumor interstitiële, de tumor celmembraan door endosome opname en endosoom membraan verstoring door de werking van de leucine ethylester of trileucine groepen. Extravasatie en endosomale opname worden betrouwbaar bereikt door de specifieke antilichamen aan de nano drug. Anti-muis transferrinereceptor antilichaam bewerkstelligt efficiënt instroom in de tumor door transcytose, waarschijnlijk omdat de receptor overexpressie meeste tumorvasculatuur. Een ander antilichaam bevestigd aan dezelfde nano conjugaatmolecuul functies specifiek richten van de nano geneesmiddel in het ontvangende tumorcel. De aanwezigheid van beide antilichamen, die voor transcytose en de andere voor endosome opname, is essentieel voor een optimale werking. Kwantitatieve analyse van mAlic zuur en antilichaam wordt sterk aanbevolen om een optimale samenstelling van de nano drug. Tenslotte moet worden opgemerkt dat de all-in-one covalente nano drug levert medicijn in chemisch bijgevoegde formulier eigen route door de gastheer vaatstelsel in de ontvangende tumorcel. Chemische bevestiging maakt de meeste drugs inactief (gemaskeerde) totdat ze worden opgelost zoals gratis drugs door splitsing van de nano conjugaat platform op de beoogde locatie. Dit is belangrijk omdat de reactivering modaliteit een hoge mate van veiligheid tijdens levering en een minimale kans op schadelijke bijwerkingen roepen. Veelzijdigheid, werkzaamheid en veiligheid zijn onmisbaar attributen van goede gepersonaliseerde geneeskunde.
Disclosures
De auteurs Julia Y. Ljubimova, Keith L. Zwart, en Eggehard Holler zijn aandeelhouders van Arrogene Technology Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
- Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
