Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

Résumé

Nous démontrons un protocole de culture cellulaire pour l’étude directe des composants neuronaux et gliaux du système nerveux entérique. Une culture mixte neurone/glie sur lamelles de recouvrement est préparée à partir du plexus myentérique de souris adulte, ce qui permet d’examiner la fonction individuelle des neurones et de la glie par électrophysiologie, immunohistochimie, etc.

Résumé

Le système nerveux entérique est un vaste réseau de neurones et de cellules gliales sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal fonctionnel qui contrôle la motilité gastro-intestinale. Une procédure pour l'isolement et la culture d'une population mixte de neurones et de cellules gliales du plexus myentérique est décrite. Les cultures primaires peuvent être maintenus pendant plus de 7 jours, avec des connexions en développement parmi les neurones et les cellules gliales. La bande de muscle longitudinal avec le plexus myentérique joint est extrait du muscle circulaire sous-jacente de l'iléon de la souris ou du côlon, et soumis à une digestion enzymatique. Dans des conditions stériles, la population neuronale et la glie isolées sont conservées au sein de la centrifugation suivant granulés et étalées sur des lamelles. 24-48 h, neurites se produit et les neurones peuvent être identifiés par des marqueurs pan-neuronales. Après deux jours de culture, les neurones isolés incendie potentiels d'action comme observé par des études de patch-clamp. En outre, les cellules gliales entériques peut aussi être identifIED par GFAP coloration. Un réseau de neurones et de cellules gliales en étroite apposition forme au sein de 5-7 jours. Neurones entériques peuvent être individuellement et directement étudiée en utilisant des méthodes telles que l'immunohistochimie, l'électrophysiologie, imagerie calcique, et PCR unicellulaire. En outre, cette procédure peut être effectuée sur des animaux génétiquement modifiés. Cette méthode est simple à réaliser et peu coûteux. Dans l'ensemble, ce protocole expose les éléments du système nerveux entérique d'une manière facile à manipuler de sorte que nous puissions mieux découvrir les fonctionnalités de l'ENS dans les états normaux et pathologiques.

Introduction

Le système nerveux entérique (SNE) est un vaste réseau de nerfs et de cellules gliales qui s’étend sur toute la longueur du tractus gastro-intestinal (GI). Le SNE contrôle fonctionnellement tous les aspects de la digestion, y compris le péristaltisme, l’absorption/sécrétion de liquide, la sensation de stimuli, etc. Il contient plus de 500 millions de neurones, plus que ce que l’on trouve dans la moelle épinière, et contient toutes les classes de neurotransmetteurs présentes dans le cerveau. De plus, le SNE est unique en ce sens qu’il peut fonctionner de manière réflexe sans intervention du système nerveux central ². La compréhension du S....

Protocole

Tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été conformes et approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Commonwealth de Virginie.

1. Préparation de lamelles en verre stériles revêtues de poly-D-lysine et de laminine en plaques à 24 puits

1. Toutes les procédures de l’étape 1 sont effectuées dans des conditions stériles, sous une cagoule et avec des réactifs stériles. Les lamelles en verre et l’eau double désionisée (ddH₂O) doivent être stérilisées à l’avance. La préparation des plaques peut être effectuée jusqu’à deux semaines avant l’isolement des n....

Résultats

Immédiatement après l'isolement des cellules issues de la couche musculaire musculaire profonde (LMMP), les neurones et les autres types cellulaires ne seront pas facilement visibles. Des cellules vivantes, rondes, au phénotype indistinct, sont observables ainsi que des débris tissulaires provenant de fragments tissulaires incomplètement digérés et du tissu conjonctif. Ce matériel est sans importance et sera en grande partie éliminé lors du premier changement de milieu dans deux jours. Ne pas essayer de nettoyer les lame.......

Discussion

Animaux utilisés

Ce protocole a été optimisé pour les souris Swiss Webster. Cependant, cette méthode est facilement adaptable à d’autres mammifères de petite taille tels que les rats et à d’autres souches de souris. Nous avons réalisé avec succès des isolements préliminaires avec des souris C57 et des knock-outs de récepteurs μ-opioïdes. Cependant, il est également possible que d’autres souches de souris puissent être problématiques en raison de variations morphologiques du tractus gastro-intesti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Reagents
Fisherbrand Coverglass pour verres de croissance (12 mm de diamètre)	Fisher Scientific	12-545-82	;
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg	;
Plaque de culture cellulaire 24 puits	CELLTREAT	229124	Peut utiliser n’importe quelle marque
Laminin	BD Biosciences	354 232	;
ddH2O			Peut être préparé en laboratoire  ;
Tube à centrifuger stérile de 15 ml	Greiner Bio-one	188261	Peut utiliser n’importe quelle marque
Tube à centrifuger stérile de 50 ml	Greiner Bio-one	227261	Peut utiliser n’importe quelle marque
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
glucose	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 média	Gibco	11330	;
du sérum fœtal bovin	Biological Inc.	110-001-101HI	Peut utiliser n’importe quelle marque
Antibiotique/antimycosique 100x liquide	Gibco	15240-062	;
Neurobasale A média	Gibco	10888	;
200 mM de L-glutamine	Gibco	25030164	;
Facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF)	Neuromics	PR27022	;
Ciseaux de dissection à pointe acérée	Fisher Scientific	8940	Peut utiliser n’importe quelle marque
Pince à disséquer	les tissus Fisher Scientific	13-812-41	Peut utiliser n’importe quelle marque
Applicateurs à pointe de coton	Fisher Scientific	23-400-101	Peut utiliser n’importe quelle marque
250 ml Bécher en verre gradué	Fisher Scientific	FB-100-250	Peut utiliser n’importe quelle marque
2 L Fiole Erlenmyer en verre	Fisher Scientific	FB-500-2000	Peut utiliser n’importe quelle marque
Tige en plastique (pinceau pour enfant)	Crayola	05 3516	Peut utiliser n’importe quelle marque
Carbogen	Airgas	UN 3156	5 % CO2
10 ml Seringue Leur-lock	Becton Dickinson	309604	Peut utiliser n’importe quelle marque
21 G x 1 1/2 po. Aiguille hypodermique	Becton Dickinson	305167	Peut utiliser n’importe quelle marque
de collagénase de type 2	Worthington	LS004174	;
Albumine sérique bovine	American Bioanalytical	AB00440	;
2 ml Microcentrifugeuse Tubes Eppendorf	Fisher Scientific	13-864-252	Peut utiliser n’importe quelle marque
Nitrex Mesh 500 µ ; M	Elko Filtering Co	100560	Peut utiliser n’importe quelle marque
Ensemble de pipettes	Fisher Scientific	21-377-328	Peut utiliser n’importe quelle marque
Pierre à aiguiser	Fisher Scientific	NC9681212	Peut utiliser n’importe quelle marque
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (hotte de culture cellulaire)	Nuaire	NU-425-400	Peut utiliser n’importe quelle marque
10 L Bain d’eau agitant	Edvotek	5027	Peut utiliser n’importe quelle marque
Microcentrifugeuse 5417R	Eppendorf	5417R	Peut utiliser une seule centrifugeuse plus grande avec des adaptateurs de taille
Centrifugeuse Allegra série 6	Beckman Coulter	366816	Peut utiliser n’importe quelle marque
HuluMixer Mélangeur d’échantillons	Invitrogen	15920D	;
Incubateur CO2 AutoFlow Water Jacket	Nuiare	NU-4750	Peut utiliser n’importe quelle marque
Balance analytique	Mettler Toledo	XS104	Peut utiliser n’importe quelle marque

Qualité